| 拆开锦囊读妙计 Takara助你轻松应对蛋白质纯化、检测实验 |
| 蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。 一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，为了研究某一个蛋白质，必须先将它从其他蛋白质和非蛋白质的分子中纯化出来。 |
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| 蛋白质纯化常规流程 |
| 亲和层析是一种常见的蛋白质纯化方法，它利用生物大分子与配基特异性结合（这种结合在一定的条件下是可逆的），达到分离提纯的目的，这种可逆结合的作用主要是靠生物大分子对它的配基的空间结构的识别。 蛋白质印迹（Western Blotting）是一种检测蛋白质的常见方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术，能对蛋白质进行定性和半定量分析。 今天向大家介绍的就是采用亲和层析的方法进行蛋白质纯化以及用Western Blotting进行蛋白质检测这一部分的实验应对方案。 |
| 对His-tag蛋白质进行纯化 |
| His标签是从事重组蛋白质表达研究的科研工作者们常用的标签蛋白质之一，通过它可以快速和高效的完成蛋白质纯化。 |
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| 标签蛋白质纯化原理（以TALON树脂为例） |
| 针对各位His-tag蛋白质纯化不同的实验要求，Takara制作了几个锦囊妙计，可以让大家在面对不同的实验难题选择合适的实验方法。 |
| 需求1：想要得到收量更多带His标签的蛋白质！ 锦囊：使用His60系列镍离子树脂纯化His标签蛋白质，产物收量高，可以达到60 mg/ml树脂，适用于大量制备。 |
 His60 镍离子树脂是一个高容量的Ni-IDA树脂，可以从细菌、哺乳动物和杆状病毒感染的细胞中，一步纯化重组的His标签蛋白。该产品属于改良型的Ni-IDA树脂，相比于其他Ni-NTA或Ni-IDA树脂来说，容量高、金属离子泄漏少，纯度高。
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| 需求2：想要得到纯度更高的带His标签的蛋白质！ 锦囊：使用TALON系列钴离子树脂纯化His标签蛋白质，产物纯度高，收量可达20 mg/ml树脂，适用于高纯度制备。 |
TALON是一种螯合固定钴离子的固定化金属离子亲和层析（IMAC）树脂，相比于镍离子树脂而言，结合His标签蛋白的特异性更高。因此，使用TALON树脂纯化可获得更高纯度的His标签蛋白。
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| 需求3：和时间赛跑，想更加快速的纯化His标签蛋白质！ 锦囊：使用Capturem™ His-Tagged系列产品可以用于His标签蛋白质的前期小量、快速以及大规模的筛选和验证。而使用大体积样品纯化套组，至多可纯化500 ml大体积样品，收量达25 mg/unit，时间仅需10-30 min。 |
| Capturem™ His-Tagged Purification Kit是以镍离子为配基，结合Capturem™ 新型膜技术开发的用于His标签蛋白质快速分离纯化的产品。与传统的固定化金属离子树脂相比，Capturem™ 系列产品以高性能的尼龙膜为介质并对其进行改造，增加了膜孔表面积，对His标签蛋白质的结合能力≥75 mg/cm3。 |
| 基于Capturem™技术的His标签蛋白质纯化方法实验流程： |
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| 需求4：想更快速、高效的完成免疫共沉淀实验 锦囊：Capturem™ IP & Co-IP Kit可以用于少量样品的Co-IP实验。实验操作速度快，抗体与样品孵育之后在室温下进行的纯化仅需5 min，由于洗脱液体积小，最终产物不会被大量稀释。而由于样品的处理更加快速，所以又避免了产物凝结或者失活，使产物质量得到保障。 |
| Capturem™快速免疫沉淀实验流程： |
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| 需求5：想快速获得抗体纯化产物！ 锦囊：Capturem™ Protein A和Capturem™ Protein G系列产品是结合Capturem™膜技术的一次性抗体纯化柱，特别适用于单克隆抗体和多克隆抗体的小量快速纯化和筛选。室温下操作即可，小量纯化操作仅需5 min，因此无须担心抗体的降解或失活。 |
| 基于Capturem™技术的抗体纯化柱使用流程： |
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| 需求6：如何利用链霉亲和素快速富集生物素化蛋白质？ 链霉亲和素是一种来源于链霉菌Streptomyces avidinii的细胞壁蛋白质，与生物素有非常强的亲和力，这一特性常被用在生物素化物质富集等相关研究。 锦囊：Capturem™ Streptavidin系列是将链霉亲和素固定在高容量的Capturem膜上，从而在室温条件下就可以对生物素化的靶标实现快速、高质量的纯化和富集，整个操作从上样到洗脱仅需5～15分钟。此外，还可以利用Capturem™ Streptavidin来捕获或pull down靶标分子或复合物。 |
| 应对Western Blotting实验 |
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| 需求1：如何降低背景影响 锦囊：可以使用Western BLoT Blocking Buffer (Fish Gelatin) ，制品添加了鱼源明胶的封闭缓冲液，同哺乳动物来源的奶粉和BSA相比，不会与哺乳动物来源抗体出现非特异性交叉反应，能够明确地检测出特异性抗原。由于是即用型试剂，无需稀释，可直接用于封闭Western印迹膜；也可作为一抗、HRP或AP标记二抗的稀释液。 也可以使用Western BLoT Blocking Buffer（Protein Free）化学成分的封闭缓冲液，不含蛋白质，同样是即用型试剂。 |
| 需求2：进行化学发光检测时，如何研讨最佳实验条件？ 由于目的蛋白质的浓度和使用的抗体浓度不同，胶片曝光条件也不同，所以有必要进行预实验探讨最佳实验条件。而使用专用缓冲液从膜上将一抗、二抗和检测试剂去除后可在同一膜上进行目的蛋白质和其他蛋白质的再次检测，由此对检测的最佳条件进行探讨。 锦囊：使用Western BLoT Stripping Buffer能在室温下从膜上温和剥离一抗和二抗但不影响膜上结合的待检测蛋白质,有助于实验者重新研讨、优化实验条件,在同一张膜上进行目的蛋白质的再次检测。 |
| 需求3：增强检测灵敏度 锦囊：Western BLoT Immuno Booster 适用于包括Western印迹和ELISA在内的各种免疫检测，可提高最终的检测灵敏度(从数倍到数十倍)。 Western BLoT Immuno Booster PF 不含蛋白质，可与Western BLoT Blocking Buffer（Protein Free）联用，在不含外源蛋白质的体系下进行检测和分析。 |
 点击图片下载 Western Blotting实验操作指南 |
页面更新：2021-10-22 10:58:24
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