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产品选择指南

技术服务信息

Capturem IP & Co-IP Kit
品牌 Code No. 产品名称 包装量 价格(元) 说明书 数量
Clontech 635721 Capturem IP & Co-IP Kit 12 Rxns ¥2,424
¥1,939

*红字为促销价格,促销时间: 2021年9月1日-2021年10月31日

无标题文档
 
基于Protein A原理的快速免疫沉淀产品
Capturem IP & Co-IP Kit
IP和Co-IP是研究蛋白质与大分子(例如其他蛋白质)之间相互作用的很有意义的实验手段。Capturem IP & Co-IP Kit应用于IP和Co-IP实验,为快速提取独立蛋白质或提取蛋白质-蛋白质复合物提供了完整、易用性的解决方案。它是一款基于新型膜技术的高性能“抗体-蛋白质”复合物纯化试剂盒,其中包含实验必备试剂,同时也提供结合、洗涤和洗脱buffer。实验从样品上样至洗脱完成仅需5min。
 
■ 产品特点
· 简单和快速的实验流程:抗体与样品孵育,之后在室温下进行的纯化仅需5 min
· 完整的解决方案:kit中包含用于IP和Co-IP实验的Capturem Protein A纯化柱和buffer,
   且均经过优化
· 高浓度:洗脱液体积小,产物浓度高
· 高质量:样品在膜上停留时间短,避免复合物的凝集、解体或失活
· 通用性强:兼容宽泛的IP buffer和实验条件
· 一次性使用:基于新型膜技术的一次性离心柱,能避免污染
 
■ 实验原理
 
Capturem Protein A 技术. 每个Capturem Protein A 纯化柱都含有高性能的改造过的Protein A 膜,表面积更大,与普通树脂相比,单位ml介质对抗体的结合能力更强。
 
■ 快速纯化流程
 
每个柱子最多可加入800 μl包含抗原抗体复合物的样品,然后用100 μl wash buffer洗涤, 30-50 μl elution buffer洗脱。每个步骤之间仅需1,000×g离心1 min,整个操作可在15min内完成。
 
■ 与主流竞争产品提取流程对比
与主流竞争产品相比,使用Capturem IP & Co-IP Kit能够显著缩短操作时间。
 
■ 实验例
实验例1
与在本实验中,将NIH3T3细胞裂解液与1 μg蛋白磷酸酶2A (PP2A) B亚基抗体进行孵育,然后上样至Capturem Protein A纯化柱。用300 μl洗涤buffer洗涤后用100 μl洗脱buffer洗脱,通过凝胶电泳分离各组分,再转移到PVDF膜上,用抗PP2A B抗体探测。结果显示在洗脱液中获得了很强的PP2A B蛋白质检测信号 (52 kDa)。
注:本实验例所使用的buffer与Capturem IP & Co-IP Kit中提供的buffer不同 (参见“实验方法:使用Capturem Protein A 纯化柱进行免疫沉淀实验”)。
 
实验方法:使用Capturem Protein A 纯化柱进行免疫沉淀实验
将1 μg的PP2A B亚基兔多抗与NIH3T3细胞裂解液在室温下孵育10 min,同时不断颠倒混合。使用400 μl的平衡/上样 buffer(1.0 M glycine, 2 M NaCl, pH9.0)对Capturem Protein A纯化柱进行平衡,1,000×g离心1 min。将抗体-裂解复合物用裂解buffer稀释至400 μl然后上样,30×g离心4 min,再用100 μl的wash buffer (PBS) 洗涤,1,000×g 离心1 min。最后使用100 μl的elution buffer (0.1 M glycine, pH2.5)进行洗脱,收集管中预先装有10 μl的中和buffer (1 M tris,pH8.5),1,000×g离心1 min。对各组分进行凝胶电泳分离,转移到PVDF膜上,使用anti-PP2A B兔源多克隆抗体 (Cell Signaling) 进行检测。
注:实验中使用的buffer是Capturem IP & Co-IP kit中优化buffer的早期配方。
 
实验例2
Capturem Protein A 产品具有出色的灵活性,能兼容广泛的实验条件,可以与其他试剂盒中的IP buffer搭配使用。为了测试该性能,将NIH3T3细胞裂解液(100 μl,含有130 μg总蛋白)与0.6 μg蛋白磷酸酶2A (PP2A) B亚基抗体分别在IP kit A,IP kit B或独立的裂解Buffer C中于4℃孵育1小时,总体积为400 μl。然后分别上样至使用对应IP buffer平衡过的Capturem Protein A纯化柱,最终使用30 μl of elution buffer洗脱一次(上图. Capturem Protein A columns A1,B1,C1),为了确保充分回收抗体复合物,重复洗脱一次(上图. Capturem Protein A columns A2,B2,C2)。同时进行的还有完全使用IP kit A和IP kit B的平行实验,按照各自的实验说明进行操作(上图. IP Kit A,IP Kit B),上样量及抗体用量与Capturem组相同。
结果显示,在原始样品(OS)中存在的组分,通过免疫沉淀操作被显著的富集了。Capturem Protein A纯化柱的结果显示,在第一次洗脱时,无论使用何种IP缓冲液,PP2A B蛋白信号都很强,用低pH甘氨酸洗脱缓冲液(A1,C1)的洗脱水平最高。
注:本实验例所使用的buffer与Capturem IP & Co-IP Kit中提供的buffer不同(参见“实验方法:使用Capturem Protein A 纯化柱进行免疫沉淀实验”)。
实验方法:测定Capturem Protein A纯化柱与不同buffer的兼容性
将NIH3T3细胞裂解液(100 μl,含有130 μg 总蛋白质)与0.6 μg的PP2A B亚基抗体在Active Motif (A) 或Thermo Fisher Scientific (B) IP试剂盒中提供的IP buffer或者是Promega 的裂解buffer (C)中进行孵育,总体积为400 μl,于4℃孵育1 h,然后上样至使用100 μl 对应IP buffer平衡过的Capturem Protein A纯化柱,1,000×g离心1 min,100 μl wash buffer洗涤,1,000×g离心1 min,然后使用30 μl的低pH buffer(0.1 M glycine,pH2.5,A和C)或Thermo Fisher Scientific的低pH elution buffer(B)于1,000×g的条件下离心洗脱,再重复洗脱一次,以确保完全洗脱抗体复合物。与此同时,我们也分别使用Active Motif 和Thermo Fisher Scientific 的IP 试剂盒按照说明书的操作步骤单独进行了实验,起始的裂解液和抗体量与使用Capturem纯化柱相同。所有洗脱产物电泳分离后转移到PVDF膜上,使用PP2A B亚基的抗体(Cell Signaling)进行检测。
注:实验中使用的buffer是Capturem IP & Co-IP kit中优化buffer的早期配方。
 
实验例3
p53是一个大小为53 kDa的核磷蛋白,具有抑制肿瘤的作用,并且在DNA损伤后参与抑制细胞增殖。已知野生型p53 能与几种病毒癌基因例如SV40 T 抗原 (SV40 T) 形成特异性复合物。使用293T细胞同时表达p53和SV40 T,我们证明了使用Capturem Protein A纯化柱能在基础水平免疫共沉淀p53和SV40 T。将Anti-SV40 T抗体加入到细胞裂解液中,室温下孵育混合物20 min,并不断颠倒混合。使用Capturem IP & Co-IP Kit中的优化buffer进行IP实验,洗脱产物经电泳分离并转移至PVDF膜。然后使用p53和SV40 T的小鼠单抗进行免疫印迹检测,Capturem Protein A 对SV40 T的IP结果显示对SV40 T进行的免疫沉淀实验在洗脱产物中同时检测到了SV40 T (97 kDa) 和p53 (53 kDa)的条带,证实了二者之间较强的相互作用(上图,E-SV40 T-1和E-SV40 T-2)。
 
实验方法:从293T细胞中免疫共沉淀p53和SV40 T抗原
以同时表达p53 和SV40 T的293T细胞为样本制备细胞裂解液。向100 μg的293T细胞裂解液中加入
1 μg的SV40T抗体 (兔多抗, V-300, SCBT),室温下孵育20 min,同时不断颠倒混合。负对照组,裂解液在不加SV40 T抗体的情况下孵育,然后使用完整的Capturem IP & Co-IP Kit一式两份进行IP实验。洗脱产物电泳分离后转PVDF膜,先用SV40 T的小鼠单抗(SCBT)进行检测,剥离后再用p53的小鼠单抗进行检测(SCBT)。
 
■ 应用
· 免疫沉淀
· 免疫共沉淀
· 蛋白质复合物研究
· 抗体工程研究中筛选抗原
 
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