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选对sgRNA,CRISPR实验成功率更有保证(文末福利)

 
北京时间2020年10月7日,诺贝尔化学奖揭晓。法国科学家埃马纽尔·夏彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)和美国科学家詹妮弗·杜德纳(Jennifer A.Doudna)获此殊荣,以表彰她们在近年来火热的CRISPR/Cas9基因编辑方面的贡献,这项简便的基因编辑技术对生命科学产生了深远的影响。
 
在CRISPR/Cas9基因组编辑技术中,将Cas9核酸酶靶向基因组特定位点,是通过由用户定义的sgRNA介导来实现的。对于sgRNA设计,现在有许多sgRNA网络在线设计工具,虽然这些工具采用的方法不同,但大多数设计工具的宗旨都是提供高靶标特异性,低脱靶效应的sgRNA序列。我们整理了一些sgRNA在线设计工具资源以及它们的基本特点,大家可以点击链接查看了解。
 
借助这些在线设计工具,可以获得针对某个特定靶标基因的多个候选sgRNA。然而,尽管运用了生物信息学对所提供的候选sgRNA进行了预测,但并非每条sgRNA都具有同等的切割效率。鉴于这种不一致性,对多条sgRNA进行筛选,从中找到切割效率最高的一条是很有必要的。
 
不同sgRNA所展现的切割效率不同。
以使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术敲除HeLa细胞CXCR4基因为例。CXCR4基因编码一种与CXCL12趋化因子相互作用的细胞表面趋化因子受体,它在免疫系统中起重要作用。在本实验中,针对CXCR4基因设计并合成了4条不同的sgRNA,使用Guide-it sgRNA Screening Kit测试了这4条sgRNA的体外切割效率。简单来讲,就是使用Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit合成了4条针对CXCR4基因的sgRNA,然后将含有sgRNA靶序列的PCR片段和重组Cas9蛋白质分别与每条sgRNA混合,建立4个体外切割反应。 反应完成后,通过琼脂糖凝胶电泳方法分析每个切割反应中sgRNA的切割效率。密度测定(Cong et al., 2013)结果显示,sgRNA3的切割效率最低(sgRNA1: ~55;sgRNA2: ~42%;sgRNA3: ~8%;sgRNA4: ~71%)。
 
 
通过体外切割效率可预测体内切割情况。
将上面所测试的四种不同sgRNA分别与编码Cas9的质粒共转染HeLa细胞,基因编辑后使用Guide-it Mutation Detection Kit分析CXCR4基因突变情况。这种测定方法使用了解离酶Guide-it Resolvase,它是一种特异性切割错配序列的核酸酶,可以用来鉴定基因编辑后细胞中特定位点的插入或缺失突变。从检测结果来看,在转染了sgRNA1、sgRNA2和sgRNA4的细胞中可以高效检测到错配序列。但是,在转染sgRNA3的细胞中所检测到的错配率是非常低的,这与上面使用Guide-it sgRNA Screening Kit所预测的sgRNA切割效率结果是一致的。
 
 
还通过流式细胞术评估了CXCR4基因敲除效率。由于CXCR4是一种细胞表面受体,因此使用FITC标记的CXCR4抗体,通过流式细胞术可以对CXCR4进行检测。流式分析结果显示,在转染了Cas9和sgRNA1、sgRNA2和sgRNA4的细胞中可以检测到CXCR4基因的正常表达受到破坏。然而,转染了Cas9和sgRNA3的细胞,CXCR4表达受到破坏的比例要小得多。这些表达功能数据进一步证实了Guide-it sgRNA Screening Kit和Guide-it Mutation Detection Kit所获得的检测结果。
 
 
以上检测结果表明,Guide-it sgRNA Screening Kit预测的体外sgRNA切割效率,与通过插入/缺失基因突变和功能基因敲除所评估的sgRNA介导的体内切割,这三者之间存在明显的相关性。这也说明在CRISPR/Cas9基因编辑研究中,Guide-it sgRNA Screening Kit是筛选高效sgRNA的一种有效方法。在进行细胞水平基因敲除实验之前,建议合成多个候选sgRNA,通常每个靶标基因建议设计4~5条sgRNA,并从中筛选出高效的sgRNA用于基因编辑实验,这是非常必要的,可以大大地降低使用无效或者低效率sgRNA的风险。
 
 
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit
通过体外转录方式简便制备高品质sgRNA,方便获得多个或者大量sgRNA用于后续筛选或者导入靶细胞,降低合成成本。
· 调整了转录起始位点,sgRNA产量可达到约12 μg以上(约为以往产品的3倍)。
· 使用高保真酶PrimeSTAR Max扩增模板DNA(sgRNA编码模板),可以减少非特异性扩增,原则上不需要切胶回收。
· 使用Clean-Up Kit柱纯化方式纯化sgRNA,无需进行繁琐的苯酚/氯仿抽提纯化。
 
Guide-it sgRNA Screening Kit
在细胞水平进行基因编辑之前,通过体外检测方法预测sgRNA切割效率,降低使用无效或者低效率sgRNA的风险,提高成功率。
· 使用Terra PCR聚合酶扩增目的DNA(DNA切割模板)。
· 可直接以细胞为起始进行扩增,无需提取基因组DNA。
· 包含Cas9蛋白质溶液:高浓度、低甘油浓度、含有NLS(核定微信号)。
 
Guide-it Mutation Detection Kit
用于基因编辑后,在筛选细胞克隆前,检测评价细胞群基因突变效率,提高细胞克隆筛选效率,检测特异性和灵敏度高。All-in-one试剂盒,无需优化,新手小白力荐。
· 通过PCR方法简单快速检出细胞基因组中导入的插入、缺失突变。
· 除了检测所需要的解离酶之外,还包含Terra PCR聚合酶和所需缓冲液。
· 使用Terra PCR聚合酶,可直接以细胞为起始进行PCR扩增,更快更高效。
 
除此之外,Takara还可以单独提供高浓度无标签重组Cas9蛋白质溶液,品质高稳定性好。与Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit所制备的sgRNA搭配使用,可在靶细胞中进行RNP(Cas9-gRNA核糖核蛋白复合物)介导的基因编辑。我们可以提供研究级和GMP级两种级别,让您随心应对基础科研和体外临床应用(仅限于研究),实现从研究到临床试验(基于研究目的)的平稳过渡。
 
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Guide-it Mutation Detection Kit 631443 100 次 5,496 4,397+赠黑胶伞,多买多赠
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit 632635 50 次 8,771 7,017
Guide-it Complete sgRNA Screening System 632636 50 次 10,701 8,561
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Guide-it Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready) 632640 100 μg x 3 6,209 4,967
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参考文献:
1. Cong, L. et al. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas9 systems. Science 339 (6121):819-23.
 
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