选对sgRNA，CRISPR实验成功率更有保证

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选对sgRNA，CRISPR实验成功率更有保证

北京时间2020年10月7日，诺贝尔化学奖揭晓。法国科学家埃马纽尔·夏彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和美国科学家詹妮弗·杜德纳（Jennifer A.Doudna）获此殊荣，以表彰她们在近年来火热的CRISPR/Cas9基因编辑方面的贡献，这项简便的基因编辑技术对生命科学产生了深远的影响。

在CRISPR/Cas9基因组编辑技术中，将Cas9核酸酶靶向基因组特定位点，是通过由用户定义的sgRNA介导来实现的。对于sgRNA设计，现在有许多sgRNA网络在线设计工具，虽然这些工具采用的方法不同，但大多数设计工具的宗旨都是提供高靶标特异性，低脱靶效应的sgRNA序列。我们整理了一些sgRNA在线设计工具资源以及它们的基本特点，大家可以点击链接查看了解。

借助这些在线设计工具，可以获得针对某个特定靶标基因的多个候选sgRNA。然而，尽管运用了生物信息学对所提供的候选sgRNA进行了预测，但并非每条sgRNA都具有同等的切割效率。鉴于这种不一致性，对多条sgRNA进行筛选，从中找到切割效率最高的一条是很有必要的。

不同sgRNA所展现的切割效率不同。

以使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术敲除HeLa细胞CXCR4基因为例。CXCR4基因编码一种与CXCL12趋化因子相互作用的细胞表面趋化因子受体，它在免疫系统中起重要作用。在本实验中，针对CXCR4基因设计并合成了4条不同的sgRNA，使用Guide-it sgRNA Screening Kit测试了这4条sgRNA的体外切割效率。简单来讲，就是使用Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit合成了4条针对CXCR4基因的sgRNA，然后将含有sgRNA靶序列的PCR片段和重组Cas9蛋白质分别与每条sgRNA混合，建立4个体外切割反应。反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳方法分析每个切割反应中sgRNA的切割效率。密度测定（Cong et al., 2013）结果显示，sgRNA3的切割效率最低（sgRNA1: ～55；sgRNA2: ～42%；sgRNA3: ～8%；sgRNA4: ～71%）。

通过体外切割效率可预测体内切割情况。

将上面所测试的四种不同sgRNA分别与编码Cas9的质粒共转染HeLa细胞，基因编辑后使用Guide-it Mutation Detection Kit分析CXCR4基因突变情况。这种测定方法使用了解离酶Guide-it Resolvase，它是一种特异性切割错配序列的核酸酶，可以用来鉴定基因编辑后细胞中特定位点的插入或缺失突变。从检测结果来看，在转染了sgRNA1、sgRNA2和sgRNA4的细胞中可以高效检测到错配序列。但是，在转染sgRNA3的细胞中所检测到的错配率是非常低的，这与上面使用Guide-it sgRNA Screening Kit所预测的sgRNA切割效率结果是一致的。

还通过流式细胞术评估了CXCR4基因敲除效率。由于CXCR4是一种细胞表面受体，因此使用FITC标记的CXCR4抗体，通过流式细胞术可以对CXCR4进行检测。流式分析结果显示，在转染了Cas9和sgRNA1、sgRNA2和sgRNA4的细胞中可以检测到CXCR4基因的正常表达受到破坏。然而，转染了Cas9和sgRNA3的细胞，CXCR4表达受到破坏的比例要小得多。这些表达功能数据进一步证实了Guide-it sgRNA Screening Kit和Guide-it Mutation Detection Kit所获得的检测结果。

以上检测结果表明，Guide-it sgRNA Screening Kit预测的体外sgRNA切割效率，与通过插入/缺失基因突变和功能基因敲除所评估的sgRNA介导的体内切割，这三者之间存在明显的相关性。这也说明在CRISPR/Cas9基因编辑研究中，Guide-it sgRNA Screening Kit是筛选高效sgRNA的一种有效方法。在进行细胞水平基因敲除实验之前，建议合成多个候选sgRNA，通常每个靶标基因建议设计4～5条sgRNA，并从中筛选出高效的sgRNA用于基因编辑实验，这是非常必要的，可以大大地降低使用无效或者低效率sgRNA的风险。

■ Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit

通过体外转录方式简便制备高品质sgRNA，方便获得多个或者大量sgRNA用于后续筛选或者导入靶细胞，降低合成成本。

· 调整了转录起始位点，sgRNA产量可达到约12 μg以上（约为以往产品的3倍）。
· 使用高保真酶PrimeSTAR Max扩增模板DNA（sgRNA编码模板），可以减少非特异性扩增，原则上不需要切胶回收。
· 使用Clean-Up Kit柱纯化方式纯化sgRNA，无需进行繁琐的苯酚/氯仿抽提纯化。

■ Guide-it sgRNA Screening Kit

在细胞水平进行基因编辑之前，通过体外检测方法预测sgRNA切割效率，降低使用无效或者低效率sgRNA的风险，提高成功率。

· 使用Terra PCR聚合酶扩增目的DNA（DNA切割模板）。
· 可直接以细胞为起始进行扩增，无需提取基因组DNA。
· 包含Cas9蛋白质溶液：高浓度、低甘油浓度、含有NLS（核定微信号）。

■ Guide-it Mutation Detection Kit

用于基因编辑后，在筛选细胞克隆前，检测评价细胞群基因突变效率，提高细胞克隆筛选效率，检测特异性和灵敏度高。All-in-one试剂盒，无需优化，新手小白力荐。

· 通过PCR方法简单快速检出细胞基因组中导入的插入、缺失突变。
· 除了检测所需要的解离酶之外，还包含Terra PCR聚合酶和所需缓冲液。
· 使用Terra PCR聚合酶，可直接以细胞为起始进行PCR扩增，更快更高效。

除此之外，Takara还可以单独提供高浓度无标签重组Cas9蛋白质溶液，品质高稳定性好。与Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit所制备的sgRNA搭配使用，可在靶细胞中进行RNP（Cas9-gRNA核糖核蛋白复合物）介导的基因编辑。我们可以提供研究级和GMP级两种级别，让您随心应对基础科研和体外临床应用（仅限于研究），实现从研究到临床试验（基于研究目的）的平稳过渡。

产品	Code No.	包装量
Guide-it Mutation Detection Kit	631448	25 次
Guide-it Mutation Detection Kit	631443	100 次
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit	632635	50 次
Guide-it Complete sgRNA Screening System	632636	50 次
Guide-it sgRNA Screening Kit	632639	50 次
Guide-it Recombinant Cas9 (3 μg/μl)	632640	100 μg x 3
Guide-it Recombinant Cas9 (3 μg/μl)	632641	100 μg

参考文献：

1. Cong, L. et al. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas9 systems. Science 339 (6121):819-23.

页面更新：2021-07-16 16:12:25

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