PrimeCap T7 RNA Polymerase(low dsRNA)是改良的T7 RNA聚合酶*,兼具Cap类似物依赖性RNA合成、低dsRNA生成和耐热性(~52℃)的特点。使用了本酶和Cap类似物的体外转录 (IVT),可大量制备具有高加帽效率的高质量mRNA,同时大幅减少具有免疫原性dsRNA的生成。因此,本制品适用于疫苗等RNA医药领域的研发。 |
*以T7启动子序列为模板,NTP为底物的双链DNA,通过转录启动子下游区域,在体外合成单链RNA的酶。 |
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典型的T7启动子序列和转录起始点(使用 CleanCap Reagent AG(TriLink公司)时的注意事项)
用于制备IVT反应的模板DNA的典型T7启动子序列如下所示。需要根据要合成的RNA序列和用于5'-cap修饰的Cap类似物的特性来设计模板,因此,请根据实验目的准备模板DNA。
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[使用CleanCap Reagent AG时]
建议转录起点(+1 位置)的 NGG 序列为 AGG
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[合成未加帽的RNA时]
建议转录起点(+1 位置)的 NGG 序列为 AGG或GGG
[使用ARCA时]
建议转录起点 (+1位置)的 NGG 序列为 GGG
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图1. FLuc mRNA合成产量(约1.9 kb)(左图)、抑制dsRNA产生效果(中图)和dsRNA含量(右图) |
以Takara IVTpro T7 mRNA合成试剂盒(Code No. 6144)的组分中的阳性对照(FLuc)作为模板,分别使用T7 RNA Polymerase ver.2.0(Code No. 2541A)和PrimeCap™ T7 RNA Polymerase (low dsRNA)(Code No. 2560A)来合成mRNA,体系为20 μl 反应,参考使用例。比较37℃下的IVT反应结果时,使用2560A合成mRNA时产生的副产物dsRNA,与2541A相比可以降低到10%甚至更低,且不会影响mRNA的合成产量。 |
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图2. 不同Cap类似物浓度的mRNA产量(左上)、加帽效率(右上)和蛋白质表达水平(左下)的比较 |
以Positive Control Template (FLuc)为模板,使用PrimeCap™ T7 RNA Polymerase (low dsRNA)(Code No. 2560A)或T7 RNA Polymerase ver.2.0(Code No. 2541A)与不同浓度(0、2、4、6、8 mM)的CleanCap Reagent AG(TriLink)进行IVT反应合成FLuc mRNA(约1.9 kb),并测定mRNA产量(左上图)。通过LC/MS测定合成的mRNA的加帽效率(右上图)。 此外,将合成的FLuc mRNA转染到HEK293细胞中,通过FLuc法评估细胞中的蛋白质表达水平(左下图)。mRNA的产量随着CleanCap Reagent AG的浓度而增加(左上图),即使使用低浓度的CleanCap Reagent AG,也显示了其高加帽效率(右上图)。此外,用该产品合成的mRNA在所有CleanCap Reagent AG浓度下都具有高蛋白质表达水平(左下图)。 |
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■ 保存 |
-20℃ |
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■ 起源 |
Escherichia coli carrying a plasmid containing the gene for phage T7 RNA polymerase variant. |
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■ 性质 |
1. 分子量:约99.8 kDa
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辅因子:Mg2+ |
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■ 活性定义 |
在 37℃,1 小时内使 1 nmol [3H] GMP 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。 |
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■ 用途 |
1. 使用Cap类似物合成带帽的mRNA(共转录加帽)
2. 用于酶法加帽的无帽RNA的合成
※ 与使用Cap类似物时相比,RNA产量减少10%~40%。
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■ 使用注意 |
1. 酶不要剧烈搅拌。
2. 当dsDNA模板、试剂、试管或微量移液器吸头被RNase污染时,合成的RNA产量会降低或者出现片段化。在实验过程中应采取预防措施以避免RNase污染,例如戴一次性手套和使用专门用于 RNA实验的试管和微量移液器吸头。
3. 为了合成长度一致的RNA,通常使用线性dsDNA(例如线性化质粒和PCR产物)用于体外转录。我们建议模板DNA末端应为5’-突出或平端,以避免出现非特异性产物。可根据具体情况,使用BspQ I等限制酶使模板DNA线性化。
4. 缓冲液中的亚精胺会与核酸形成复合物并可能产生沉淀,因此模板DNA应在加酶之前即倒数第二步再加入反应体系中。
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