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cDNA Library Construction Kit
品牌 Code No. 产品名称 包装量 价格(元) 说明书 数量
Takara 6136 cDNA Library Construction Kit 5 Rxns ¥9,980
 
■ 制品内容 (5 次量)
PrimeScript RTase(200 U/μl) 5 μl
RNase Inhibitor (40 U/μl) 5 μl
Oligo(dT)18 Anchor Primer (1 μg /μl)*1 10 μl
5×1st Strand Synthesis Buffer*2 20 μl
1st Strand dNTP Mixture 6 μl
E.coli RNase H/E.coli DNA Ligase Mixture 10 μl
E.coli DNA Polymerase I (20 U/μl) 10 μl
2nd Strand dNTP Mixture 23 μl
5×2nd Strand Synthesis Buffer*2 150 μl
T4 DNA Polymerase (1 U/μl) 20 μl
10×T4 DNA Ligase Buffer 20 μl
T4 DNA Ligase (350 U/μl) 20 μl
EcoR I-Sma I Adaptor (0.4 μg/μl) 18 μl
Not I Supplement 135 μl
Not I (50 U/μl) 15 μl
tRNA (10 μg/μl) 5 μl
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (4℃保存)*3 60 μl
3 M Sodium Acetate (pH5.2) (4℃保存) 1 ml
pAP3neo Predigested Vector (100 ng/μl)*4 5 μl
RNase-free H2O 640 μl
Control RNA (1 μg/μl)*5 5 μl
T7 Promoter Primer (5 pmol/μl)*6 20 μl
T3 Promoter Primer (for pAP3neo) (5 pmol/μl)*6 20 μl
Spin Column (CHROMA SPIN-1000+DEPC-H2O Columns*7) (4℃保存) 5 支
 
*1 Oligo(dT)18 Anchor Primer中含有Not I Site及Xho I Site。如果不用Not I 而用Xho I 进行酶切时,也可以制备EcoR I-Xho I 双链cDNA片段构建cDNA文库,利用这些Site的载体 (不可去磷酸化) 也可用来构建cDNA文库。另外,本试剂盒中不含有Xho I 酶,需要时请另外购买。
*2 与PrimeScript Double Strand cDNA Synthesis Kit[Code No.: 6111A] 中所含有的组份不同。
*3 同Dr. GenTLE Precipitation Carrier (Code No.: 9094)。
*4 经EcoR I、Not I 酶切处理。
*5 本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒 (质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kb的pBR322来源的DNA片段,该DNA片段上含有抗四环素基因) 为模板,由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的,Control RNA (约1.4 kb )的3’端具有30 个A碱基的Poly(A)+尾。以这种RNA为模板合成的双链cDNA插入到适当的质粒载体中后,如果插入的cDNA确实为全长,那这种质粒便可获得四环素抗性。
*6 可用于Insert Check及DNA测序。
*7 Clontech Laboratories公司产品。 (带下盖)
(注) 本制品不含对电转化法十分重要的大肠杆菌。使用本制品时,需用大肠杆菌的感受态细胞转化甲基化DNA。可采用E. coli HST08 Premium Electro-Cells (Code No.: 9028)、Clontech的Stellar Electrocompetent Cells (Clontech Code: 636756)
 
■ 制品说明
利用真核生物的各种组织或细胞中的Poly(A)+RNA合成cDNA,然后进行基因克隆,这在分子生物学实验中被广泛应用。这一技术的使用,使基因的结构解析及目的蛋白的表达等变得更为方便。
一般合成cDNA以及构建cDNA Library的方法为: ① 合成与目的Poly(A)+RNA相互补的双链cDNA;② 将双链cDNA与细菌或病毒来源的载体进行重组; ③ 将重组体导入细菌或真核细胞内进行扩增,构建cDNA Library。构建成的cDNA Library可以用于cDNA的解析,或者进一步进行体外转录或体外翻译等。
本试剂盒原理采用了Gubler-Hoffman法 (Linker Primer法),是一种可以控制克隆基因方向性的Directional Cloning法,其原理见下图,具体说明如下:
1. 利用反转录酶PrimeScript RTase和Oligo(dT)18 Anchor Primer1,3-5)合成1st Strand cDNA。1st Strand cDNA合成时使用5-methyl dCTP。
2. E.coli RNase H使mRNA-1st Strand cDNA杂合体中的RNA形成Nick,再使用E.coli DNA Ploymerase和E.coli DNA Ligase将RNA链置换成DNA链,合成2nd Strand cDNA。
3. 使用T4 DNA Polymerase将双链cDNA末端平滑化。
4. 与Adaptor连接后,使用Not I 进行酶切。
5. 使用Spin Column除去短链cDNA。
6. 与Vector pAP3neo进行连接 (Directional Cloning)。
7. 利用电刺激转化法导入大肠杆菌。
8. 确认克隆效率及插入片段大小等。
 
■ cDNA Library合成原理图
 
 
保存
Dr. GenTLE Precipitation Carrier 4℃保存。
3 M Sodium Acetate (pH5.2) 4℃保存。
Spin Column 4℃保存。
其他组份 -20℃保存。
 
 

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