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| CRISPR基因编辑技术将会是肿瘤治疗领域的下一匹“黑马”吗？ |
| CRISPR/Cas9基因编辑技术有望成为肿瘤治疗领域的下一匹“黑马”。 |
| CRISPR/Cas9基因编辑技术在针对特异位点的靶向肿瘤治疗方面具有巨大潜力。人乳头瘤病毒（HPV）基因E6和E7，通过破坏正常的细胞周期和肿瘤抑制功能来发挥抗细胞死亡的作用。Cas9介导的人乳头瘤病毒E7癌基因的破坏，无论是体外还是体内，会致使人乳头瘤病毒诱导的癌变得到显著抑制（Lao et al. 2018）［1］。 |
| CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤免疫治疗中所显现出的效果也较为乐观，可以有效破坏肿瘤细胞免疫逃逸机制。经过修饰的嵌合抗原受体（CAR）T细胞，可以有效提高对肿瘤的靶向性和破坏性。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，可以对T细胞基因组进行敲入修饰，成功构建CAR-T细胞。Kagoya et al., 2018报道，通过抑制DOT1L，它是一种组蛋白H3赖氨酸79甲基转移酶，可以减轻异体T细胞反应［2］ |
| 2020年2月，《科学》杂志发表文章，美国宾夕法尼亚大学Carl H. June教授团队使用CRISPR/Cas9基因编辑技术对T细胞进行了基因修饰用于肿瘤治疗，公布了临床试验结果。本文研究者使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了T细胞中两个内源性T细胞受体编码基因TCRα和TCRβ以及PD-1基因，使用慢病毒载体导入了靶标抗原。实验结果证明，经过CRISPR/Cas9技术多次编辑的T细胞不仅是安全的，而且在体内的持续时间更久，表现了持续的攻击和杀死肿瘤的能力［3］。 |
| 2020年4月，《Nature Medicine》杂志在线发表文章，四川大学华西医院中国科学家卢铀教授团队利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在体外T细胞中编辑PD-1基因，经体外T细胞培养扩增，再输回非小细胞肺癌（NSCLC）受试者，首次证明了该疗法在NSCLC中的安全性和可行性。卢铀教授团队在世界范围内最早开展CRISPR/Cas9基因编辑人体试验。2016年7月，《Nature》杂志率先报道卢铀教授团队计划开展首个CRISPR/Cas9基因编辑人体临床试验，并于2016年10月进行了首例受试者治疗。时隔4年之后，终于等来了临床试验数据公布，无疑令人兴奋［4］。 |
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| Workflow for T-cell-based therapies |
| ● 有优势就有挑战 |
| 这些具有突破性的临床试验结果，展示了CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤治疗中的潜力，为肿瘤所困患者带来了希望。不过，尽管CRISPR/Cas9基因编辑技术显示了巨大的应用潜力，但是使用该技术进行免疫治疗研究的过程中，如何高效导入是一个非常大的挑战，也就是说通过什么样的方式可以把Cas9核酸酶和单向导RNA（sgRNA）有效、安全而且尽可能低副作用地运送到目标细胞中，这是一个难题。 |
| ● 直面挑战，逆行而上 |
| 面对如何将Cas9核酸酶和单向导RNA（sgRNA）有效、安全、正确地运送到目标细胞中，我们来看看这些科学家们是如何做的吧。 |
| Carl H. June教授团队和卢铀教授团队，在使用CRISPR/Cas9基因编辑技术对T细胞进行编辑的过程中，均使用了电穿孔方法，这种方法可以直接将Cas9-gRNA核糖核蛋白（RNP）复合物导入T细胞进行基因编辑，而不需要借助病毒载体。 |
| 这就不得不提到，2018年加州大学旧金山分校（UCSF）研究团队在《自然》杂志上发表文章，Alexander Marson教授和他的同事揭示了一种高效的T细胞改造方法，通过共电穿孔的方式将Cas9-gRNA核糖核蛋白（RNP）复合物与双链DNA(dsDNA)或单链DNA(ssDNA) HDR模板共同导入至目标细胞。在这项研究中，使用了电穿孔方法而不是病毒传递的方式，最大限度地降低细胞毒性。利用这一方法，作者迅速纠正了T细胞中自体免疫相关的遗传突变，这些T细胞来自于患有罕见的单基因遗传病的同胞；同时通过这一方法对来源于健康供体的T细胞进行了重编程，经过重编程的T细胞在体外和体内模型中都成功地靶向了癌细胞。作者在开发这种非病毒的T细胞重编程方法时，不仅设计了一种更适合临床应用的解决方案，而且还将T细胞改造所需要的时间从数年或数月缩短到了数周，大大降低了成本，加快了发现的步伐，扩大了发现的可能性。作者在Cas9：HDR模板比率和电转实验条件优化上花费了大量时间，单就这一点而言，在未来的许多年里可能会使研究界受益匪浅［5］。 |
| 在以上三项突破性研究中，科学家们都是通过电穿孔方法将Cas9-gRNA核糖核蛋白（RNP）复合物导入至T细胞中进行有效基因编辑的，所使用的Cas9核酸酶均为无标签重组Cas9蛋白质。 |
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| 使用RNP进行基因编辑的一般过程 |
| ● 技术优势和趋势 |
| 与质粒载体和病毒载体导入方法相比，通过电穿孔等方法（也可以使用显微注射或者转染方法）直接导入Cas9-gRNA核糖核蛋白（RNP）复合物进行基因编辑，具有以下优势： |
| · 不使用Cas9基因，从而有效抑制由于基因残留使Cas9持续表达造成的脱靶现象 · 不存在由于蛋白质转录、翻译表达所引起的时间滞后，可实现快速有效的突变导入 · 不需要考虑每个靶向生物的启动子和密码子 · 可以控制导入的Cas9蛋白质的量 |
| 研究表明，直接使用核糖核蛋白复合物（RNP：“Cas9蛋白质”和“向导RNA”的复合物) 进行基因编辑，可有效降低脱靶效应。RNP导入细胞后，会迅速激活DNA剪切活性，快速切断靶标序列。另外，RNP在细胞内能够快速分解，有效避免靶标序列以外的相似序列被切断，降低脱靶效应。RNP可以通过电穿孔、显微注射以及转染的方法导入至靶标细胞［6］。 |
| Google Scholar检索结果显示，使用RNP进行基因编辑的文章，我们发现无论使用哪种导入法（电穿孔、显微注射、转染），相关文章数量都在逐年增加；以Cas9 “clinical trials”为关键词进行检索，发表文章逐年上升，2019年发表文章数量已超过5,000篇；以GMP Cas9 “clinical trials”为关键词进行检索，发表文献相对较少，但也呈现逐年上升的趋势。 |
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| 关于无标签重组Cas9蛋白质，Takara可以提供GMP级和研究级两种级别，品质高稳定性好，让您随心应对基础科研和体外临床应用（仅限于研究），实现从研究到临床试验（基于研究目的）的平稳过渡。 |
| ■ GMP级别重组Cas9蛋白质 |
| Recombinant Cas9 Protein GMP grade（Code No. T230）按照日本厚生劳动省（“PFSB Notification No. 0709002，2008年7月9日”；PFSB=医药食品安全局）发布的以下指南进行生产和测试：“Standards for Manufacturing Control and Quality Control, etc. of Investigational Products (Investigational products GMP)”。 |
| 本Cas9蛋白质溶液成分经过了优化，对哺乳动物细胞具有良好的耐受性，可降低导入哺乳动物细胞时所造成的细胞损伤。将此Cas9蛋白质和gRNA制备的RNP复合物，通过电穿孔、显微注射等方式导入至靶细胞进行敲除实验，经验证该Cas9蛋白质溶液对哺乳动物细胞具有良好的耐受性。 |
| · 不含人源或动物源成分 · 不包含his标签序列，适用于多种不同应用 · 与单向导RNA（sgRNA）形成RNP复合物，可通过电穿孔或者显微注射方式导入 · 适用于不同细胞类型和不同生物体进行基因编辑 |
| 以下数据由京都大学iPS细胞研究所（CiRA）临床应用研究部门主任研究员/特聘据点讲师堀田秋津先生、以及堀田研究室博士研究员徐淮耕先生提供。堀田秋津先生和徐淮耕先生比较了Recombinant Cas9 Protein GMP grade与其它公司Cas9蛋白质产品的性能。下图中误差线代表S.D.（标准偏差）。他们进行了3组实验，分别将5 μg A公司Cas9、A公司Cas9突变体、B公司Cas9以及本公司Cas9和sgRNA（0.625 μg×2种）通过电穿孔方式导入至人iPS细胞中，分别或者同时敲除两种细胞表面蛋白质A（Gene A）、B（Gene B）。通过流式细胞术检测表面蛋白质A和B的表达情况，实验结果表明，在本实验中，使用本公司Cas9获得的敲除效率是最高的（下图所示）。在不同的实验组中，本公司的GMP级别Cas9蛋白质稳定地展示出了高敲除效率。 |
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| * 比较结果来自于Takara Bio USA, Inc. |
| ■ GMP级别重组Cas9蛋白质 |
| Guide-it Recombinant Cas9 (3 μg/μl) （Code No. 632640/632641）来源于野生型酿脓链球菌，适用于CRISPR/Cas9基因编辑实验的研究级别重组Cas9蛋白质溶液。 |
| · 高蛋白质浓度，尤其适用于电穿孔导入方法 · 甘油含量低，对活体损伤更小 · 含有NLS（核定位信号），导入后迅速转运至细胞核 · 与Guide-it Complete sgRNA Screening System（Code No. 632636）组合使用实现高效率的基因编辑 |
| 我们比较了不同公司Cas9产品在hiPS細胞中基因敲除效率。剪切后电泳条带的强弱可以半定量估计发生基因编辑细胞的百分数。Guide-it Recombinant Cas9（3 μg/μl）与Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit制备的sgRNA相结合，通过电穿孔的方法导入Cellartis hiPSC-18细胞，采用Guide-it Mutation Detection Kit（Code No. 631448）确认突变导入效率，％即表示基因编辑效率。如图所示，Guide-it Recombinant Cas9（3 μg/μl）在多数靶基因位点均显示有效的基因编辑。检测结果显示，使用Guide-it Recombinant Cas9（3 μg/μl）对于本实验所检测的靶基因都可以实现有效的突变导入。 |
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| * 比较结果来自于Takara Bio USA, Inc. |
| 肿瘤一直都是困扰人类健康的难题，肿瘤治疗研究也是数年来的科学难题。虽然基因编辑技术应用于肿瘤治疗还需要攻克基因脱靶、安全性、有效性等方面的诸多问题，但这些研究和临床试验结果无疑是令人鼓舞的。希望有了基因编辑技术的加持，肿瘤治疗研究可以有进一步的突破，让更多人类无力抗争的肿瘤疾病从无望治疗变成有望治愈。 |
| 正所谓，人生路上，步履不停，我们会一直向前走。科学家们不会停下致力于攻克肿瘤的脚步，Takara公司也将致力于不断为科学家提供高品质的研究工具，为生命科学研究和产业支援提供支持。 |
| 参考文献： |
| ［1］ Lao Y. H. et al. HPV Oncogene Manipulation Using Nonvirally Delivered CRISPR/Cas9 or Natronobacterium gregoryi Argonaute. Adv. Sci. 1700540 (2018). ［2］ Kagoya Y. et al. DOT1L inhibition attenuates graft-versus-host disease by allogeneic T cells in adoptive immunotherapy models. Nat. Communications 9, 1915 (2018). ［3］ EA Stadtmauer et al., CRISPR-Engineered T Cells in Patients with Refractory Cancer. Science. (2020). ［4］ You Lu et al. Safety and feasibility of CRISPR-edited T cells in patients with refractory non-small-cell lung cancer. Nature Medicine. (2020). ［5］ Roth, T.L et al., Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nat. Lett. 559, 405–409 (2018). ［6］ Hendriks, WT. et al., Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions. Cell Stem Cell. 2016, 18(1): 53. |
页面更新：2021-07-16 16:12:37
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