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CRISPR基因编辑技术将会是肿瘤治疗领域的下一匹“黑马”吗?
 
CRISPR/Cas9基因编辑技术有望成为肿瘤治疗领域的下一匹“黑马”。
 
CRISPR/Cas9基因编辑技术在针对特异位点的靶向肿瘤治疗方面具有巨大潜力。人乳头瘤病毒(HPV)基因E6和E7,通过破坏正常的细胞周期和肿瘤抑制功能来发挥抗细胞死亡的作用。Cas9介导的人乳头瘤病毒E7癌基因的破坏,无论是体外还是体内,会致使人乳头瘤病毒诱导的癌变得到显著抑制(Lao et al. 2018)[1]
 
CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤免疫治疗中所显现出的效果也较为乐观,可以有效破坏肿瘤细胞免疫逃逸机制。经过修饰的嵌合抗原受体(CAR)T细胞,可以有效提高对肿瘤的靶向性和破坏性。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术,可以对T细胞基因组进行敲入修饰,成功构建CAR-T细胞。Kagoya et al., 2018报道,通过抑制DOT1L,它是一种组蛋白H3赖氨酸79甲基转移酶,可以减轻异体T细胞反应[2]
 
2020年2月,《科学》杂志发表文章,美国宾夕法尼亚大学Carl H. June教授团队使用CRISPR/Cas9基因编辑技术对T细胞进行了基因修饰用于肿瘤治疗,公布了临床试验结果。本文研究者使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了T细胞中两个内源性T细胞受体编码基因TCRα和TCRβ以及PD-1基因,使用慢病毒载体导入了靶标抗原。实验结果证明,经过CRISPR/Cas9技术多次编辑的T细胞不仅是安全的,而且在体内的持续时间更久,表现了持续的攻击和杀死肿瘤的能力[3]
 
2020年4月,《Nature Medicine》杂志在线发表文章,四川大学华西医院中国科学家卢铀教授团队利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在体外T细胞中编辑PD-1基因,经体外T细胞培养扩增,再输回非小细胞肺癌(NSCLC)受试者,首次证明了该疗法在NSCLC中的安全性和可行性。卢铀教授团队在世界范围内最早开展CRISPR/Cas9基因编辑人体试验。2016年7月,《Nature》杂志率先报道卢铀教授团队计划开展首个CRISPR/Cas9基因编辑人体临床试验,并于2016年10月进行了首例受试者治疗。时隔4年之后,终于等来了临床试验数据公布,无疑令人兴奋[4]
 
Workflow for T-cell-based therapies
 
● 有优势就有挑战
这些具有突破性的临床试验结果,展示了CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤治疗中的潜力,为肿瘤所困患者带来了希望。不过,尽管CRISPR/Cas9基因编辑技术显示了巨大的应用潜力,但是使用该技术进行免疫治疗研究的过程中,如何高效导入是一个非常大的挑战,也就是说通过什么样的方式可以把Cas9核酸酶和单向导RNA(sgRNA)有效、安全而且尽可能低副作用地运送到目标细胞中,这是一个难题。
 
● 直面挑战,逆行而上
面对如何将Cas9核酸酶和单向导RNA(sgRNA)有效、安全、正确地运送到目标细胞中,我们来看看这些科学家们是如何做的吧。
 
Carl H. June教授团队和卢铀教授团队,在使用CRISPR/Cas9基因编辑技术对T细胞进行编辑的过程中,均使用了电穿孔方法,这种方法可以直接将Cas9-gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物导入T细胞进行基因编辑,而不需要借助病毒载体。
 
这就不得不提到,2018年加州大学旧金山分校(UCSF)研究团队在《自然》杂志上发表文章,Alexander Marson教授和他的同事揭示了一种高效的T细胞改造方法,通过共电穿孔的方式将Cas9-gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物与双链DNA(dsDNA)或单链DNA(ssDNA) HDR模板共同导入至目标细胞。在这项研究中,使用了电穿孔方法而不是病毒传递的方式,最大限度地降低细胞毒性。利用这一方法,作者迅速纠正了T细胞中自体免疫相关的遗传突变,这些T细胞来自于患有罕见的单基因遗传病的同胞;同时通过这一方法对来源于健康供体的T细胞进行了重编程,经过重编程的T细胞在体外和体内模型中都成功地靶向了癌细胞。作者在开发这种非病毒的T细胞重编程方法时,不仅设计了一种更适合临床应用的解决方案,而且还将T细胞改造所需要的时间从数年或数月缩短到了数周,大大降低了成本,加快了发现的步伐,扩大了发现的可能性。作者在Cas9:HDR模板比率和电转实验条件优化上花费了大量时间,单就这一点而言,在未来的许多年里可能会使研究界受益匪浅[5]
 
在以上三项突破性研究中,科学家们都是通过电穿孔方法将Cas9-gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物导入至T细胞中进行有效基因编辑的,所使用的Cas9核酸酶均为无标签重组Cas9蛋白质。
 
使用RNP进行基因编辑的一般过程
 
● 技术优势和趋势
与质粒载体和病毒载体导入方法相比,通过电穿孔等方法(也可以使用显微注射或者转染方法)直接导入Cas9-gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物进行基因编辑,具有以下优势:
· 不使用Cas9基因,从而有效抑制由于基因残留使Cas9持续表达造成的脱靶现象
· 不存在由于蛋白质转录、翻译表达所引起的时间滞后,可实现快速有效的突变导入
· 不需要考虑每个靶向生物的启动子和密码子
· 可以控制导入的Cas9蛋白质的量
 
研究表明,直接使用核糖核蛋白复合物(RNP:“Cas9蛋白质”和“向导RNA”的复合物) 进行基因编辑,可有效降低脱靶效应。RNP导入细胞后,会迅速激活DNA剪切活性,快速切断靶标序列。另外,RNP在细胞内能够快速分解,有效避免靶标序列以外的相似序列被切断,降低脱靶效应。RNP可以通过电穿孔、显微注射以及转染的方法导入至靶标细胞[6]
 
Google Scholar检索结果显示,使用RNP进行基因编辑的文章,我们发现无论使用哪种导入法(电穿孔、显微注射、转染),相关文章数量都在逐年增加;以Cas9 “clinical trials”为关键词进行检索,发表文章逐年上升,2019年发表文章数量已超过5,000篇;以GMP Cas9 “clinical trials”为关键词进行检索,发表文献相对较少,但也呈现逐年上升的趋势。
 
 
● 助力科研,提供专业服务
关于无标签重组Cas9蛋白质,Takara可以提供GMP级和研究级两种级别,品质高稳定性好,让您随心应对基础科研和体外临床应用(仅限于研究),实现从研究到临床试验(基于研究目的)的平稳过渡。
 
■ GMP级别重组Cas9蛋白质
Recombinant Cas9 Protein GMP grade(Code No. T230)按照日本厚生劳动省(“PFSB Notification No. 0709002,2008年7月9日”;PFSB=医药食品安全局)发布的以下指南进行生产和测试:“Standards for Manufacturing Control and Quality Control, etc. of Investigational Products (Investigational products GMP)”。
 
本Cas9蛋白质溶液成分经过了优化,对哺乳动物细胞具有良好的耐受性,可降低导入哺乳动物细胞时所造成的细胞损伤。将此Cas9蛋白质和gRNA制备的RNP复合物,通过电穿孔、显微注射等方式导入至靶细胞进行敲除实验,经验证该Cas9蛋白质溶液对哺乳动物细胞具有良好的耐受性。
 
· 不含人源或动物源成分
· 不包含his标签序列,适用于多种不同应用
· 与单向导RNA(sgRNA)形成RNP复合物,可通过电穿孔或者显微注射方式导入
· 适用于不同细胞类型和不同生物体进行基因编辑
 
以下数据由京都大学iPS细胞研究所(CiRA)临床应用研究部门主任研究员/特聘据点讲师堀田秋津先生、以及堀田研究室博士研究员徐淮耕先生提供。堀田秋津先生和徐淮耕先生比较了Recombinant Cas9 Protein GMP grade与其它公司Cas9蛋白质产品的性能。下图中误差线代表S.D.(标准偏差)。他们进行了3组实验,分别将5 μg A公司Cas9、A公司Cas9突变体、B公司Cas9以及本公司Cas9和sgRNA(0.625 μg×2种)通过电穿孔方式导入至人iPS细胞中,分别或者同时敲除两种细胞表面蛋白质A(Gene A)、B(Gene B)。通过流式细胞术检测表面蛋白质A和B的表达情况,实验结果表明,在本实验中,使用本公司Cas9获得的敲除效率是最高的(下图所示)。在不同的实验组中,本公司的GMP级别Cas9蛋白质稳定地展示出了高敲除效率。
 
* 比较结果来自于Takara Bio USA, Inc.
 
■ GMP级别重组Cas9蛋白质
Guide-it Recombinant Cas9 (3 μg/μl) (Code No. 632640/632641)来源于野生型酿脓链球菌,适用于CRISPR/Cas9基因编辑实验的研究级别重组Cas9蛋白质溶液。
 
· 高蛋白质浓度,尤其适用于电穿孔导入方法
· 甘油含量低,对活体损伤更小
· 含有NLS(核定位信号),导入后迅速转运至细胞核
· 与Guide-it Complete sgRNA Screening System(Code No. 632636)组合使用实现高效率的基因编辑
 
我们比较了不同公司Cas9产品在hiPS胞中基因敲除效率。剪切后电泳条带的强弱可以半定量估计发生基因编辑细胞的百分数。Guide-it Recombinant Cas9(3 μg/μl)与Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit制备的sgRNA相结合,通过电穿孔的方法导入Cellartis hiPSC-18细胞,采用Guide-it Mutation Detection Kit(Code No. 631448)确认突变导入效率,%即表示基因编辑效率。如图所示,Guide-it Recombinant Cas9(3 μg/μl)在多数靶基因位点均显示有效的基因编辑。检测结果显示,使用Guide-it Recombinant Cas9(3 μg/μl)对于本实验所检测的靶基因都可以实现有效的突变导入。
 
* 比较结果来自于Takara Bio USA, Inc.
 
肿瘤一直都是困扰人类健康的难题,肿瘤治疗研究也是数年来的科学难题。虽然基因编辑技术应用于肿瘤治疗还需要攻克基因脱靶、安全性、有效性等方面的诸多问题,但这些研究和临床试验结果无疑是令人鼓舞的。希望有了基因编辑技术的加持,肿瘤治疗研究可以有进一步的突破,让更多人类无力抗争的肿瘤疾病从无望治疗变成有望治愈。
 
正所谓,人生路上,步履不停,我们会一直向前走。科学家们不会停下致力于攻克肿瘤的脚步,Takara公司也将致力于不断为科学家提供高品质的研究工具,为生命科学研究和产业支援提供支持。
 
参考文献:
[1] Lao Y. H. et al. HPV Oncogene Manipulation Using Nonvirally Delivered CRISPR/Cas9 or Natronobacterium gregoryi Argonaute. Adv. Sci. 1700540 (2018).
[2] Kagoya Y. et al. DOT1L inhibition attenuates graft-versus-host disease by allogeneic T cells in adoptive immunotherapy models. Nat. Communications 9, 1915 (2018).
[3] EA Stadtmauer et al., CRISPR-Engineered T Cells in Patients with Refractory Cancer. Science. (2020).
[4] You Lu et al. Safety and feasibility of CRISPR-edited T cells in patients with refractory non-small-cell lung cancer. Nature Medicine. (2020).
[5] Roth, T.L et al., Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nat. Lett. 559, 405–409 (2018).
[6] Hendriks, WT. et al., Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions. Cell Stem Cell. 2016, 18(1): 53.
 
 
 

页面更新:2021-07-16 16:12:37