| 抗体的快速高通量纯化 |
| 在抗体药物研发的初期，研究人员需要预测和筛选大量的抗体药物靶标，进而发现关键的靶点，然后摸索优化培养条件，从众多杂交瘤细胞中筛选出阳性克隆、检测抗体亲和力和特异性等。这一系列的过程都离不开抗体纯化的操作步骤，但常规树脂纯化方法预处理和纯化时间长，柱床体积大，并且对操作环境和操作设备都有较高要求，不便于开展大规模小量样品的筛选和验证性实验，往往成为限速步骤，即使是选择操作较为简便、耗时较短的磁珠纯化法，也难免实验前要对磁珠进行分装、预处理，实验中要进行的孵育以及频繁的移液操作，在进行高通量筛选时，人力和时间仍是捉襟见肘！因此，如果能将纯化步骤提速，对抗体药物临床前研发的进程将会有巨大的推动作用。 Takara的Capturem Protein A 和Protein G系列产品可以为抗体纯化提供快速高通量的解决方案。该系统基于Capturem膜技术，膜上偶联能够特异性的与IgG的Fc片段结合的ProteinA或ProteinG，可满足抗体小量快速纯化和96 well大规模快速筛选，兼具快速、易用、灵活和高产量（与同等体积树脂比较）等特点。 |
| 【原理对比】 |
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| *ProteinA、ProteinG与抗体的结合能力根据抗体同种型（isotype）的不同而不同，实际产量受样品类型、物种和抗体同种型影响。 |
| 【实验操作流程】 |
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| 使用Capturem Protein A会使工作流程更加连贯，减少抗体纯化和筛选的工作量，从而产生高质量的抗体。操作过程就如同提质粒般简单，每步操作之间进行1 min离心，小量纯化的总净化时间仅为5 min，96 well高通量纯化可在15 min内完成。膜的柱床体积<3μl，超过80％的抗体可以用低至100μl的洗脱液实现高浓度洗脱。 |
| 【实验案例】 |
| 使用Capturem Protein A技术快速筛选杂交瘤以获得最佳Cas9单克隆抗体实例 |
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| 图A，SDS-PAGE 凝胶电泳检测不同克隆子的Capturem纯化产物。图B，将Cas9表达量低(lane #1)和高(lane #2)的细胞裂解液分别进行凝胶电泳并转膜，再使用Capturem™ Protein A Maxiprep纯化得到的抗体对其进行免疫印迹反应。图C，使用筛选到的Cas9抗体，对不同比例稀释(从左至右: 20 ng, 10 ng, 5 ng, 2.5 ng, 1.25 ng, 0.625 ng)的Cas9 蛋白质进行免疫印迹反应。由上图可以看出，使用Capturem Protein A技术能在短时间内高效的对多个转化子所表达的抗体进行纯化和筛选。 Capturem膜技术法能够显著缩短操作时间，增加通量，其易用性能让实验新人更快熟悉操作流程，保证数据重复性。 |
| 【扩展应用】 |
| 使用Capturem柱上快速标记抗体 |
| 标记抗体（Abs）是研究人员扩大抗体应用的关键方法之一，抗体-药物偶联物就是其中一种，近年来发展迅速。传统的偶联方法需要纯化的起始材料以及较长的孵育时间，为了改进这一过程，我们利用了Capturem技术，可直接对未纯化的起始材料进行快速的柱上偶联，从而在15分钟内标记抗体。 |
| 直接在任意起始溶液中快速标记抗体的工作流程 |
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| 荧光素标记抗体的结果 |
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| 以含有小鼠Cas9抗体的杂交瘤培养基为起始材料（150 μg抗体），使用荧光素-NHS共轭物在Capturem Protein G Miniprep Columns上进行快速抗体标记，最终获得40 μg荧光标记抗体。nc：负对照；泳道1：12当量反应；泳道2：20当量反应；泳道3：50当量反应；泳道4：100当量反应。右图表示每个泳道都有相等质量的抗体，左图表示荧光信号随标记反应中荧光素浓度的增加而增加。 |
| 生物素标记抗体的结果 |
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| 生物素标记的实验方案与荧光素标记的相同，但使用生物素-NHS作为标记试剂。左图为标记抗体的Western Blot结果，表明>90%的生物素标记抗体可在前两步洗脱操作中获得。右图为使用生物素标记的抗体对重组Cas9 (rCas9)进行Western Blot检测的结果，表明使用Capturem Protein G Miniprep进行柱上标记和洗脱后，结合表位仍然保持活性。 |
| 【Capturem快速操作视频】 |
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页面更新：2020-04-22 09:18:53
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