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使用10 kb或更大的长链通过多重PCR进行长读长NGS分析


多重PCR是一种通过在单个PCR反应体系中使用多对引物，同时扩增多个基因区域的方法。多重PCR可以节省试剂和耗材从而降低成本，并且可以通过同时检测提高速度，能够更有效地利用珍贵的样品。然而，多重PCR容易产生非特异性扩增，存在引物设计复杂、反应优化等缺点。在这项研究中，我们使用具有高特异性的PCR酶PrimeSTAR^® LongSeq DNA Polymerase（Code No. R055S/A）来评估长链多重PCR的可行性（实验例1）。 R055也是一种高保真DNA聚合酶，适用于对保真性要求较高的下一代测序（NGS）分析。因此，我们对使用长读长测序（Oxford Nanopore Technologies）分析了通过长链多重PCR获得的扩增产物（实验例2）。


图1. 改为实验流程

■ 实验例1：20重长链多重PCR实验

● 方法 ·酶的使用： PrimeSTAR^® LongSeq DNA Polymerase 适用于长链扩增的其他公司PCR酶 ·模板：人类基因组 DNA ·片段：所有20个片段（长度：10-12 kb，GC 含量：35-60%） ·反应体系：在50μl反应体系中添加100ng的人类基因组DNA作为模板，各引物的最终浓度为0.2μM。 ·PCR条件： PrimeSTAR^® LongSeq DNA Polymerase
94℃ 1 min
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98℃ 10 sec.		30 cycles
68℃ 30 sec/kb

其他公司的PCR酶：说明书推荐的PCR条件 PCR反应在N=2条件下进行仪器：Clontech PCR Thermal Cycler GP（Code No. WN400）

● 结果

图2. 20重片段的多重PCR 在纯化多重PCR产物后，使用4200 TapeStation System（Agilent Technologies）进行分析。结果表明使用R055可以特异性地扩增10～12 kb附近的片段。
（Takara Bio Inc.比较结果）

■ 实验例2：NGS 分析

● 方法在实验例1中确认有三个酶可以扩增10～12 kb附近的片段，使用Native Barcoding Kit 96 V14（Oxford Nanopore Technologies）构建NGS文库，并使用GridION（Oxford Nanopore Technologies）和R10.4.1 flow cells (Oxford Nanopore Technologies)进行NGS分析。对长读长NGS获得的碱基序列进行了读取数一致的分析。此外，在本实验中未优化引物浓度，而是使用了等摩尔混合的引物组。

图3. 各酶的靶向区域覆盖（On-Target）

根据生成的序列读数，计算了各酶的靶向区域覆盖。使用R055扩增的产物显示出99%以上的靶标覆盖率，表明R055在长链多重PCR中具有较高的特异性扩增。

图4. 20重PCR的深度均匀性校验

在多重PCR中，各PCR靶标的扩增效率差异是一个问题。我们确认了在各个PCR 酶的扩增产物中是否含有20个靶标的序列。通过使用R055可以用于实现更均匀的扩增。相比之下，其他公司的PCR酶在多个靶标上没有产生深度或产生极低的深度，但使用R055可以获得更少偏差的均匀深度。对于难以扩增的区域，即使增加测序量也难以改善，测序成本会上升。使用R055可以减少多重反应PCR的优化工作，并能够以更小的测序量进行分析。
（Takara Bio Inc.比较结果）




图4. 目标区域全长的扩增确认

使用Integrative Genomics Viewer（IGV）来确认各酶的多重PCR扩增产物中是否包含20个靶标序列。R055可以在所有20个靶标上进行全长扩增，但其他公司的PCR酶缺少部分区域，只能在68-78%的靶标上进行全长扩增。 *未获得靶标L读数的区域属于用于验证的人基因组DNA中已知的大缺失区域（976 bp）。
（Takara Bio Inc.比较结果）

● 结论在本次验证中，评估了六种PCR酶，并确认了三种PCR酶可以通过20个靶标的多重PCR进行特异性扩增。在三种PCR酶中，R055是唯一获得所有20个靶标区域全长序列的PCR酶。研究表明，PCR酶的选择对于通过长链多重PCR对靶标区域进行全长NGS分析至关重要。