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使用R055时的引物设计

R055的特性：
R055具有非常高的特异性，需要引物Tm值至少为70℃。与普通PCR酶相比，R055需要更高的Tm值。如果现有引物的Tm值不够高，则可能无法获得良好的扩增。因此，建议延长引物的5'端长度来提高Tm值。
根据“推荐引物设计方法”进行验证，如下所示：

推荐引物设计方法：
● 强烈建议设置35 mer左右（Tm 值> 70℃）
● 如果Tm值低于70℃，则通过三步PCR将退火温度至少降低5℃
● 在多重PCR中匹配引物的Tm值
● 由于Tm值低的引物可能无法扩增，因此建议尽可能使用Tm值为70℃或者更高的引物，最好为74℃或者更高
● 通过使用3'端硫代磷酸盐修饰的碱基可以获得良好的扩增

验证内容：
引物：在低Tm值延伸引物的5'端，设计Tm值为44-77℃的引物（图1）
PCR条件：两步PCR或三步PCR（退火温度分别为68℃和57℃）（图2）
模板：人基因组DNA（100 ng/50 μl 反应体系）
目标：β-globin 24 kb PCR
PCR仪：Clontech PCR Thermal Cycler GP (Code No. WN400)

结果：
在两步PCR中，当退火温度设置为68℃，引物Tm值为69℃或更高时，24 kb的长链可以扩增。在三步PCR中，退火温度设置为57℃，引物Tm值为62℃或更高时， 24 kb的长链可以扩增。但使用短引物，24 kb的长链未扩增（图2）

图1. 引物序列和Tm值

图2. PCR条件和结果