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Poly（A）序列后面剩余的碱基数与翻译效率的关系

图1.BspQ I的识别序列、切割位点和反转图像
Type IIS限制酶的BspQ I的识别序列 (红框) 和切割位点 (蓝箭头) 。切割位点位于识别序列之外。

图2.含有Poly（A）的IVT模板DNA质粒的限制酶识别序列设计、线性化后的末端结构及IVT RNA序列
为了探讨Poly (A) 序列以后残留碱基的影响，使用限制酶处理质粒，使Poly（A）序列后残留的碱基数量不同，形成对照。用含有CleanCap Reagent AG (3OMe) 和N1-Methylpseudo-UTP的IVT反应合成了FLuc mRNA。IVT RNA的Poly (A) 之后的残留碱基序列以红色字母表示。
※Hind III (3 nt剩余) 的设计与Linearized Template Vector (Code No. 6143的产品组分) 相同。

图3 HEK 293 T细胞Poly (A) 序列剩余碱基数量对mRNA翻译效率的影响
使用TransIT-mRNA Transfection Reagent，将获得的0.5 μg RNA转染到HEK 293 T细胞中。24小时后回收细胞，测定FLuc的活性。结果显示，由残留23 nt的质粒模板制备的mRNA，与其他相比，活性明显降低。
另一方面，残留碱基为5 nt以下的情况下均显示出高活性，虽然差别不大，但随着残留碱基的减少，活性呈现上升的趋势。由于在剩余碱数为0 nt时翻译效率最大，因此在设计以mRNA合成为目的的模板DNA质粒时，推荐使用BspQ I等Type IIS限制酶。
※Poly（A）在序列下游的残留碱基为3 nt的Hind III线性化时，虽然翻译效率略有下降，但与剩余碱基0 nt的结果差别不大。