无标题文档
Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System

 
通过体外转录(IVT)反应合成的 mRNA产量和 mRNA细胞转染效率
 
A.使用CleanCap Reagent AG (3' OMe)时RNA的产量
B.使用CleanCap Reagent AG (3' OMe)合成的FLuc mRNA在HEK293T细胞中的表达
 
A) 分别在 IVT反应液中加入和不加入CleanCap Reagent AG (3'OMe)的情况下,合成Firefly luciferase (萤火虫荧光素酶 ,FLuc) mRNA的产量。由此可见,使用 CleanCap对合成的RNA产量没有影响。
B) 使用 TransIT-mRNA转染试剂盒(Code No. MIR2225/MIR2250/MIR2255/MIR2256)将A中获得的 0.5 μg RNA转染到HEK293T 细胞中。24小时后,收集细胞并测定FLuc的活性,结果表明,含有CleanCap的IVT反应液合成的FLuc mRNA与市面上销售的FLuc mRNA positive control具有相同的活性。另一方面,在未加入CleanCap的IVT反应液中合成的FLuc mRNA没有观察到活性。这表明Cap结构对于mRNA有效翻译成蛋白质是必不可少的。
 

模板DNA加量与RNA产量的关系(20 μl反应体系)

 
使用不同量的Positive Control Template (FLuc) 作为模板(20 μl 反应体系),加入 CleanCap Reagent AG (3'OMe) 和N1-甲基假尿苷进行IVT反应。结果显示,RNA 产量在模板DNA 0.5 μg 时达到峰值,而高于该模板加量(0.5~2 μg)时,RNA产量变化很小。
 
 

IVT反应液体积与RNA产量的关系

 
A.IVT反应液体积与RNA产量的关系
线性关系
每20μl反应溶液的RNA产量 (μg)
 
B. 使用Bioanalyzer分析RNA产物
 
A) 以Positive Control Template(FLuc)为模板,加入 CleanCap Reagent AG (3'OMe) 进行IVT放大实验。除反应液体积外均按说明书所述进行。 由此可见,RNA 产量与反应体积成正比,并且按比例放大反应溶液体积不会影响产量。
B) 对A中获得的 1 ng RNA产物通过Bioanalyzer分析表明:IVT反应体积的放大不会影响RNA产物的质量。
 

IVT反应液体积与RNA产量的关系

 
A.IVT反应时间与RNA产量的关系分析
B.使用Bioanalyzer分析RNA产物
 
A) 使用Positive Control Template (FLuc)作为模板,加入CleanCap Reagent AG (3'OMe) 和N1-甲基假尿苷进行不同反应时间的IVT 反应。结果显示,当合成的mRNA的长度为大约1.9 kb时,RNA产量在约1小时内几乎趋于平稳,并且在此之后(1~16小时)观察到的变化很小。
B) 对A中获得的1 ng RNA产物通过Bioanalyzer分析表明:反应时间不会影响RNA产物的质量。
 
 

IVT合成RNA后纯化回收效果的比较(产量和质量的比较)

 
A.通过 LiCl 沉淀法与离心柱法进行RNA纯化的比较
B.不同方法纯化的FLuc mRNA在HEK293T细胞中的表达情况
 
A) 在含有CleanCap Reagent AG(3'OMe)和N1-甲基假尿苷的IVT反应液中合成FLuc mRNA,并分别通过LiCl沉淀法和离心柱法(NucleoSpin RNA Clean-up(Code No. 740948.10等))进行纯化。 结果显示,用离心柱法仅一次洗脱(Elution x1)得到的RNA比LiCl沉淀法少,但两次洗脱(Elution x2)的RNA量与LiCl沉淀法大致相同。所以我们强烈建议在使用离心柱法时进行两次洗脱。
B) 使用TransIT-mRNA Transfection Kit将A中获得的0.5 μg RNA转染到HEK293T细胞中。24小时后,收集细胞,测定FLuc的活性,确认两者的活性与市面上销售的FLuc mRNA positive control相同甚至更高。