Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System |
通过体外转录(IVT)反应合成的 mRNA产量和 mRNA细胞转染效率 |
A.使用CleanCap Reagent AG (3' OMe)时RNA的产量 B.使用CleanCap Reagent AG (3' OMe)合成的FLuc mRNA在HEK293T细胞中的表达 |
A) 分别在 IVT反应液中加入和不加入CleanCap Reagent AG (3'OMe)的情况下,合成Firefly luciferase (萤火虫荧光素酶 ,FLuc) mRNA的产量。由此可见,使用 CleanCap对合成的RNA产量没有影响。 B) 使用 TransIT-mRNA转染试剂盒(Code No. MIR2225/MIR2250/MIR2255/MIR2256)将A中获得的 0.5 μg RNA转染到HEK293T 细胞中。24小时后,收集细胞并测定FLuc的活性,结果表明,含有CleanCap的IVT反应液合成的FLuc mRNA与市面上销售的FLuc mRNA positive control具有相同的活性。另一方面,在未加入CleanCap的IVT反应液中合成的FLuc mRNA没有观察到活性。这表明Cap结构对于mRNA有效翻译成蛋白质是必不可少的。 |
模板DNA加量与RNA产量的关系(20 μl反应体系) |
使用不同量的Positive Control Template (FLuc) 作为模板(20 μl 反应体系),加入 CleanCap Reagent AG (3'OMe) 和N1-甲基假尿苷进行IVT反应。结果显示,RNA 产量在模板DNA 0.5 μg 时达到峰值,而高于该模板加量(0.5~2 μg)时,RNA产量变化很小。 |
IVT反应液体积与RNA产量的关系 |
A.IVT反应液体积与RNA产量的关系
线性关系
每20μl反应溶液的RNA产量 (μg)
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B. 使用Bioanalyzer分析RNA产物 |
A) 以Positive Control Template(FLuc)为模板,加入 CleanCap Reagent AG (3'OMe) 进行IVT放大实验。除反应液体积外均按说明书所述进行。 由此可见,RNA 产量与反应体积成正比,并且按比例放大反应溶液体积不会影响产量。 B) 对A中获得的 1 ng RNA产物通过Bioanalyzer分析表明:IVT反应体积的放大不会影响RNA产物的质量。 |
IVT反应液体积与RNA产量的关系 |
A.IVT反应时间与RNA产量的关系分析
B.使用Bioanalyzer分析RNA产物
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A) 使用Positive Control Template (FLuc)作为模板,加入CleanCap Reagent AG (3'OMe) 和N1-甲基假尿苷进行不同反应时间的IVT 反应。结果显示,当合成的mRNA的长度为大约1.9 kb时,RNA产量在约1小时内几乎趋于平稳,并且在此之后(1~16小时)观察到的变化很小。 B) 对A中获得的1 ng RNA产物通过Bioanalyzer分析表明:反应时间不会影响RNA产物的质量。 |
IVT合成RNA后纯化回收效果的比较(产量和质量的比较) |
A.通过 LiCl 沉淀法与离心柱法进行RNA纯化的比较
B.不同方法纯化的FLuc mRNA在HEK293T细胞中的表达情况
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A) 在含有CleanCap Reagent AG(3'OMe)和N1-甲基假尿苷的IVT反应液中合成FLuc mRNA,并分别通过LiCl沉淀法和离心柱法(NucleoSpin RNA Clean-up(Code No. 740948.10等))进行纯化。 结果显示,用离心柱法仅一次洗脱(Elution x1)得到的RNA比LiCl沉淀法少,但两次洗脱(Elution x2)的RNA量与LiCl沉淀法大致相同。所以我们强烈建议在使用离心柱法时进行两次洗脱。 B) 使用TransIT-mRNA Transfection Kit将A中获得的0.5 μg RNA转染到HEK293T细胞中。24小时后,收集细胞,测定FLuc的活性,确认两者的活性与市面上销售的FLuc mRNA positive control相同甚至更高。 |