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使用Capturem胰蛋白酶技术消化蛋白质和全细胞裂解物

Capturem胰蛋白酶
■ 提供快速和高效的蛋白质消化
■ 能够消化紧密折叠的蛋白质
■ 生成具有高序列覆盖率的肽
■ 适用于全细胞裂解液的蛋白质组学分析

简介

质谱（MS）是用于蛋白质组学和对来自多种生物和细胞类型的蛋白质进行表征分析的主要技术。MS分析中最重要的步骤是样品制备，需要将蛋白质转化为肽。胰蛋白酶是最常用的蛋白质水解酶，可制备用于分析的肽。它是一种高度特异性的丝氨酸蛋白酶，在赖氨酸和精氨酸残基的羧基侧切割，产生MS分析最佳大小的肽。因此，快速和完全消化对于详细的蛋白质表征分析非常重要。
目前的样品制备操作是在胰蛋白酶溶液中进行37℃过夜消化。蛋白质的长时间消化可能造成氧化或其他蛋白质修饰，导致灵敏度差，从而降低了溶液内消化的可重复性，并且也不适合自动化。此外，溶液法胰蛋白酶消化不能完全消化蛋白质，从而影响了MS分析中的蛋白质鉴定。
Capturem Trypsin可快速、有效、完全地消化蛋白质样品，在室温下让MS工作流程更加连贯，以进行下游蛋白质分析。该产品的形式是小型离心柱，应用我们的新型Capturem膜技术，膜上固定有胰蛋白酶。Capturem Trypsin柱可用不到一分钟的时间完全消化蛋白质样品，其消化效率（蛋白质覆盖率）与使用溶液法胰蛋白酶消化的效率相当或更好。快速蛋白质消化不仅可以节省时间，还可以通过减少胰蛋白酶自溶来改善蛋白质组学分析中肽和蛋白质的鉴定。

实验结果

■ 使用Capturem Trypsin进行快速、完全的蛋白质消化

使用apomyoglobin (Apo) （肽图谱的常用标准），我们比较了溶液法胰蛋白酶消化与Capturem Trypsin消化法的效率。Apo缺乏二硫键，因此在酶消化之前不需要变性和/或还原。胰蛋白酶消化的完全性通常用来衡量消化效率。图1显示使用Capturem Trypsin仅需500 g离心1分钟就可以对Apo样品进行100％的消化（图C），而用溶液法胰蛋白酶在16小时后仅消化了70％的Apo样品，从图中可以看到明显的完整Apo的色谱峰（图B）。

图1. 使用Capturem Trypsin实现Apomyoglobin（Apo）的快速完全消化。上图为使用RP-HPLC分析Capturem Trypsin法和常规溶液法消化蛋白质的结果，图A为未消化的完整蛋白质，图B为溶液法室温消化16 h的蛋白质，图C为使用Capturem Trypsin消化1 min的蛋白质。离心柱活化、蛋白质消化以及RP-HPLC分析方法参见“实验方法”部分内容。

■ 使用Capturem Trypsin消化紧密折叠的蛋白质

溶液法胰蛋白酶消化的另一个限制是如果没有额外的样品处理步骤（例如变性和还原），则不能消化高度折叠的蛋白质。Myoglobin (Myo) 就是这样一个例子，它是紧密折叠的球状蛋白质，使用溶液法胰蛋白酶对其消化效果很差。如图2所示，Capturem Trypsin柱仅需500 g离心1分钟就可以将Myo消化成许多蛋白水解肽（图C）。相反，溶液法胰蛋白酶消化16小时（图B）未能产生任何蛋白水解肽，并且大多数Myo仍然未被消化。

图2. 使用Capturem Trypsin消化紧密折叠的Myoglobin (Myo)。使用RP-HPLC对Capturem Trypsin法和常规溶液法消化的产物进行分析，图A为未消化的完整蛋白质，图B为溶液法室温消化16 h的蛋白质，图C为使用Capturem Trypsin消化1 min的蛋白质。离心柱活化、蛋白质消化以及RP-HPLC分析方法参见“实验方法”部分内容。

■ 对Capturem Trypsin消化的蛋白质进行质谱分析

除了确定消化的完全性之外，测量所得肽的序列覆盖百分比为评估胰蛋白酶消化效率提供了另一种方法。为了确定Capturem Trypsin如何有效地产生具有良好序列覆盖的肽，我们对用Capturem Trypsin消化的Apo进行了质谱分析（MS）分析。图3显示了使用Capturem Trypsin消化的Apo的解卷积ESI-Orbitrap质谱。仅在500 g下离心1分钟即可完全消化Apo。MS分析鉴定出26种Apo的肽，其中7种肽覆盖100％的氨基酸序列。

图3. 对Capturem Trypsin消化肌球蛋白（Apo）产生的肽进行质谱分析。对Capturem Trypsin离心柱上消化的Apo，使用Xtract软件生成解卷积ESI-Orbitrap质谱。实验数据由University of Notre Dame的Dr. Merlin Bruening提供。

■ Capturem Trypsin消化全细胞裂解物的蛋白质组学分析

我们使用Capturem Trypsin对由BT474导管乳腺癌细胞制成的全细胞裂解物进行蛋白质组学分析，以鉴定出尽可能多的特别蛋白质。变性的全细胞裂解物通过RP-HPLC（图4，图A）分成19份，对每份用Capturem Trypsin消化。表1中提供了使用Capturem Trypsin消化的每份蛋白质的含量。针对每份消化的蛋白质分别进行LC / MS-MS分析。图4，图B显示了每份鉴定得到的特别的蛋白质的数量。总之，使用Capturem Trypsin对BT474细胞消化然后进行蛋白质组学分析，共鉴定出2,320种特别蛋白质。

Table 1. Protein amount per fraction used for Capturem Trypsin digestion
Fraction	Protein amount (μg)	Fraction	Protein amount (μg)
1	32.22	11	35.19
2	35.08	12	33.12
3	33.75	13	26.88
4	41.76	14	31.88
5	41.76	15	29.41
6	38.21	16	26.48
7	38.21	17	25.98
8	38.40	18	24.63
9	30.32	19	21.48
10	35.23

图4. 使用Capturem Trypsin消化BT474全细胞裂解物的蛋白质组学分析。通过RP-HPLC将裂解液分成19个独立的组分（图A），然后再使用Capturem Trypsin对每个组分分别进行消化，并使用如下的“实验方法”进行LC/MS-MS分析，鉴定并绘制出每个组分中带有至少2个特异性肽段的蛋白质总数，如B图所示。

结论

与溶液法胰蛋白酶消化相比，Capturem Trypsin 提供更快和更完全的消化，防止因蛋白质消化时间过长和/或不完全而影响灵敏度和重现性。当同时使用两种方法消化apomyoglobin（一种用作蛋白质作图的标准模型蛋白质）时，结果显示，使用Capturem Trypsin 消化速度更快、更完全。而使用Capturem Trypsin 在消化myoglobin（一种紧密折叠的蛋白质）时，也同样显示了非常高的效率。使用质谱法对Capturem Trypsin消化的apomyoglobin产物进一步分析，证实其消化产生的肽具有良好的序列覆盖度。使用Capturem Trypsin消化复杂样品（一种通过RP-HPLC分离的全细胞裂解物），再用LC / MS-MS分析可鉴定出2,320种特别蛋白质。这些性能都证明了Capturem Trypsin是用于蛋白质组学分析的强大工具。

实验方法

■ 使用Capturem Trypsin消化Apo和Myo

在消化之前，将Apo (80 μg) 或Myo (10 μg) 溶解在200 μl的10 mM碳酸氢铵中。取200 μl试剂盒提供的活化buffer加到Capturem Trypsin离心柱上，500 g离心1分钟以激活柱子。然后将Apo或Myo溶液加到已活化的柱上，500 g离心1分钟。洗脱得到的肽进行下游的RP-HPLC和MS分析。

■ 使用溶液法胰蛋白酶消化Apo和Myo

将Apo (80 μg) 或Myo (10 μg) 溶解在200 μl的10 mM碳酸氢铵中，用于溶液法胰蛋白酶消化。以胰蛋白酶：底物为1:20（w / w）的比率消化4 μg的Apo或0.5 μg的Myo。然后将反应混合物在室温下孵育约16小时。

■ 对消化的Apo和Myo进行RP-HPLC分析

使用Rainin Dynamax HPLC系统进行RP-HPLC分析。用Aeris 3.6 μm PEPTIDE XB-C18色谱柱（100?，50 x 4.6 mm）（Phenomenex）经两种溶液梯度洗脱（溶液 A：95%水 + 5%乙腈 + 0.1% TFA [v/v]；溶液B：10％水+ 90％乙腈+ 0.085％TFA [v / v]）并于215 nm下进行分析。应用以下梯度程序：95％溶液A持续2分钟，5-60％溶液B持续24分钟，60-70％溶液B持续1分钟，70％溶液B持续2分钟。加样前用95％溶液A进行5分钟的平衡。加样体积为20 μl。

■ 质谱分析Capturem Trypsin消化的Apo

对于直接注入式MS，洗脱的肽需要经SpeedVac干燥并在1％乙酸、49％H2O和50％甲醇的溶液中重构样品。然后将40 μl重构的样品加载到Whatman Multi-Chem 96孔微孔板（Sigma-Aldrich）中，并用Teflon Ultrathin Sealing Tape（Analytical Sales and Services）密封。使用Advion Triversa Nanomate纳米电喷雾电离（nESI）源（Advion）将样品引入配备有双压力离子阱、HCD池和ETD的高分辨率、高质量精度LTQ Orbitrap Velos质谱仪（Thermo Fisher Scientific）。喷雾电压和气体压力分别设定为1.4kV和1.0psi。离子源界面的入口温度为200℃，S-Lens值为57％。使用FT分析仪以100,000的质量分辨率操作，在300-1,800的m / z范围内以正电离模式获得高分辨率质谱。光谱是100次扫描的平均值。分析具有> 1％的最高峰强度和S / N> 3的信号。使用ProteinProspector（v 5.14.1，University of California，San Francisco）对肽进行手动鉴定，分析包括最多5个酶漏切位点，质量耐受性设定为10 ppm，不匹配设置为2。

■ BT474全细胞裂解物的蛋白质组学分析

在洛杉矶南加州大学的Kian Kani教授的实验室中使用由BT474乳腺导管癌细胞制成的全细胞裂解物进行蛋白质组学分析。简言之，将BT474细胞在PBS，1％OG中裂解，其中添加有蛋白酶和磷酸酶抑制剂。然后将细胞裂解物在盐酸胍终浓度为6 M的PBS/OG进行还原（5 mM DTT）和烷基化（50 mM IAA）。使用液相色谱/串联质谱（LC / MS-MS）以数据依赖模式进行蛋白质鉴定。为了降低样品复杂性，需要进行初始的RP-HPLC蛋白质分级分离，方法是注射2 mg蛋白质裂解物（在含3 M盐酸胍的PBS中）然后每30秒收集1 ml组分，总共19个单独的组分，然后冷冻，用SpeedVac干燥。将每个组分重悬于含有1 M尿素+ 1％乙腈（ACN）的100 mM碳酸氢铵缓冲液（pH8.0）中，总体积为200 μl。使用Capturem Trypsin按照Protocol-At-A-Glance中所述方法分别消化每个组分，并向每个柱洗脱液中加入2 μl乙酸以终止消化反应，然后用C18ZipTip过滤器清洗，冷冻，并用SpeedVac干燥。
然后将每个组分重悬于25 μl的H2O / ACN / FA（体积比为95/5/0.1）溶液（至大约2 μg/μl的浓度）中。每个重悬组分取10 μl注入LTQ-FTICR或LTQ-ORBITRAP质谱仪（Thermo-Finnigan）进行LC-MS / MS检测，所述质谱仪与带有25 cm柱（Picofrit 75 μm ID, New Objectives）的纳流液色谱系统（Eksigent）偶联，柱子内部装有MagicC18树脂（Michrom Bioresources），线性梯度为90分钟。以随机顺序对19个样品进行MS。获取的数据由 Computational Proteomics Analysis System自动处理。针对人类国际蛋白质索引数据库（60,428个蛋白质条目）的3.13版本搜索串联质谱，添加5个人和牛胰蛋白酶序列。搜索是用X！Tandem（2005.12.01）进行的。在搜索期间将前体离子的质量耐受性设定为1AMU，碎片离子的质量公差设定为0.5道尔顿。但是，低于百万分之五质量准确度的匹配被认为是假阳性并忽略。将PeptideProphet概率大于0.9的所有鉴定物提交至ProteinProphet，随后的蛋白质鉴定以1％错误率用胰蛋白酶片段（2个漏切位点）过滤，允许固定修饰C = 57.021，可变修饰C = -17.027, E = -18.011, K = 6.020, M = 15.995, Q = -17.027。通过每种蛋白质中存在2种或更多种肽来鉴定蛋白质。