Takara

Recombinant Cas9 Protein GMP grade

哺乳动物细胞基因组编辑

※参考资料：Guide-it Recombinant Cas9 (3 μg/μl) User Manual

[实验条件]

· 靶细胞/基因：293T细胞/CD81
· RNP导入方法：电穿孔（使用仪器：Neon Transfer System [Thermo Fisher Scientific]）
· RNP制备条件：
使用单向导RNA (sgRNA) 0.45 μg、本制品0.75 μg/0.25 μl、Resuspension Buffer R（或者T）混合配制7.5 μl溶液、37℃孵育5分钟后， 4℃静置。
RNP导入条件：
收集细胞，PBS洗涤后，使用Buffer R将细胞重悬至2×10⁷cells/ml。将7.5 μl细胞悬浊液和7.5 μl RNP溶液相混合，根据仪器操作手册将RNPs导入至靶细胞中。使用以下3种条件进行电穿孔实验（N=3）（表1）。

条件	脉冲电压（V）	脉冲宽度（ms）	脉冲数
A	1,300	20.0	2
B	1,200	20.0	2
C	1,100	20.0	2

基因编辑效率评价方法：

在上述条件下进行电穿孔导入后，将细胞培养7天，然后与PE标记的抗CD81抗体反应，通过FCM检测CD81阴性细胞率（%）。

[实验结果]

图．基因编辑功能评价

比较A-C导入条件下的基因敲除效率，A条件下脉冲电压设定在1,300 V，所获得的靶标基因CD81敲除效率最高（85.4％）。