Takara

预扩增偏差比较实验

预扩增实验不能引入偏差，以确保下游实验数据分析的准确性。在无偏差预扩增优势的实验中，有些基因的Ct＜20。我们进行了以下实验，以确定是因为优先选择了这些引物进行了偏差扩增，还是只是因为这些基因在起始样本中水平表达较高。使用相同的cell cycle panel，对使用Prelude PreAmp Master Mix进行了10个循环预扩增后的100 pg cDNA（蓝色）以及没有预扩增的20 ng cDNA（紫色）样本进行了比较。结果显示，96个基因的Ct值高度相似，一致性较高。因此，使用Prelude PreAmp Master Mix进行10个循环预扩增，可以在不引入偏差的情况下，使用qPCR检测100 pg的起始cDNA样本。

请注意，虽然上图显示了PrimerArray Cell Cycle (Human) panel中全部96个目的基因的定量结果，但是为了保证可读性，x轴仅显示部分基因名称。完整的目的基因定量结果，详见Excel。

在某些极端情况下，低起始量样本或相对拷贝数低的基因，可能需要进行14个循环的预扩增，而不是10个。通常情况下，循环圈数越多，带入偏差的可能性就越大。为了解决这个问题，我们对使用Prelude PreAmp Master Mix进行了10个循环预扩增（蓝色）或者14个循环预扩增（紫色）的100 pg样本进行了比较。值得注意的是，预扩增循环圈数从10圈增加到14圈，样本表达趋势相同。

为了进一步证明使用Prelude PreAmp Master Mix进行预扩增的偏差性小，我们用10圈预扩增和14圈预扩增产生的Ct值计算ΔΔCt值后进行分析。ΔΔCt值在±0.75范围内是确保无偏差预扩增最严格的方法之一。下图实验中的96个基因都符合这一要求，这一结果表明，即使进行多达14圈的预扩增实验，Prelude PreAmp Master Mix依然能够很好的获得100 pg的cDNA样本无偏差预扩增实验结果。