In-Fusion Cloning:更快速地得到比TOPO克隆更准确的结果

 
【数据提供】Juanita Von Dwingelo
Ph.D. Candidate, University of Louisville
 
【实验简介】
Juanita Von Dwingelo和她的同事一直在通过酵母双杂交研究目的蛋白质和宿主蛋白质之间的相互作用。TOPO克隆方法已成为克隆这些目的蛋白质的标准工作流程的一部分,然而,TOPO克隆方法却导致了克隆实验花费时间长并且结果通常不可靠。当他们尝试使用In-Fusion Cloning构建质粒时,他们发现获得阳性克隆结果所花费的时间减少了两天,并得到了100%的克隆效率。
 
【用户感言】
“我们的实验室主要使用一种耗时很长且结果不可预测的方法将目的蛋白质克隆到不同的载体中。以前我们使用过TOPO方法。。。 这是一个相对冗长的过程,从开始到结束平均需要五天。我们的实验室进行了相当多的克隆,因此找到一种更快捷的克隆方法会很有用。”
-Juanita Von Dwingelo
 
【结果】
使用BamH I和Sal I双酶切将酵母双杂交诱饵载体pGBKT7线性化,从嗜肺军团菌中PCR扩增真核样锚蛋白质效应子AnkH,使用引物在PCR产物末尾加入线性化载体末端序列。凝胶纯化PCR扩增产物,定量后与线性化载体进行In-Fusion克隆反应,反应液转化试剂盒中包含的感受态细胞,菌落PCR鉴定阳性克隆。克隆方案的总时间为3天,检测的10个菌落中有10个含有正确的插入片段。
 
【用户感言】
“我肯定会再次使用[In-Fusion Cloning],因为与其他克隆方法相比,这是一个非常简单快速的过程,而其他方法需要更多的时间,而且不那么可靠。”
-Juanita Von Dwingelo
 
【结论】
In-Fusion技术改进了酵母双杂交实验中目的蛋白质克隆的工作流程,提高了克隆速度和准确性。观察到的克隆效率为100%,而之前使用的TOPO克隆方法效率仅为50-75%。此外,使用In-Fusion系统进行克隆所花费的时间更少,之前方法需五天时间,而In-Fusion三天内就完成了目的载体的构建。
 
 
 
详细实验方法和步骤请见:
https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/outperforming-topo-cloning