In-Fusion Cloning:成功地直接克隆大的表达载体

 
【数据提供】Ansul Lokdarshi
Graduate Research Assistant, University of Knoxville, TN
 
【实验简介】
下面实验中使用了In-Fusion Cloning构建植物中YFP标签蛋白质定位研究的正对照载体。无需传统连接方法的亚克隆操作,我们直接将黄色荧光蛋白质(YEP)克隆到一个植物双向载体上,启动子为花椰菜花叶病毒双35S启动子(CaMV D35S)。通过限制酶酶切和测序来筛选确认阳性克隆。从实验设计到完成、确认克隆,整体时间比连接酶的方法少了两天。
 
【结果】
PCR扩增获得包含目标载体5’和3’末端序列的插入片段(图1),PCR生成了一个单一的清晰的正确大小条带(图2左侧)。利用In-Fusion酶将插入片段克隆到线性表达载体上,检测3个克隆均为阳性克隆,对其中一个克隆通过限制酶作图确认(图2右侧)。最终构建的质粒长度约9.5 kb,一次克隆实验即成功了。
 
图1.构建后的载体图示。最终的载体是一个表达载体,用于植物研究,YFP与D35S启动子在同一阅读框中
 
图2. 得到了单一清晰条带,并以100%的准确率克隆至线性载体上。左图,插入片段的PCR扩增结果。使用CloneAmp HiFi PCR premix扩增了YFP(740 bp)片段。引物引入了适用于In-Fusion克隆的5'-和 3'-末端。右图,构建质粒用限制酶消化后的电泳图。使用Nco I 和Xba I酶切质粒,得到与预期大小一致的条带。
 
【结论】
In-Fusion Cloning仅通过一次克隆实验,即完成了阳性表达载体的构建,达到了100%的成功率。不需要亚克隆,从实验设计到完成确认比传统连接酶的方法减少了两天。
 
 
 
详细实验方法和步骤请见:
https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/direct-cloning-into-large-vectors