In-Fusion Cloning:高效的单片段和多片段克隆方法

 
【数据提供】Dr. Samuel Bru
Postdoc, Orphan Cyclins Group
Universitat Internacional de Catalunya
 
【实验简介】
Dr. Josep Clotet课题组的Dr. Samuel Bru及其同事定期从酿酒酵母中纯化重组嵌合蛋白质;该小组试图寻找一种快速、简便的方法来克隆其工作所需的嵌合蛋白质。在这项研究中,使用了In-Fusion克隆和基于连接酶的克隆两种方法来平行测试克隆单个和多个插入片段的效果,分别克隆一个,两个或三个插入片段。通过限制酶消化筛选菌落,克隆效率为从10个随机选择的菌落中获得的阳性克隆的数量,在5个独立实验中取平均值。
 
通过直接比较两种克隆方法的结果,他们发现由于传统T4 DNA连接酶的克隆方法效率低,一步法克隆多片段是非常困难的。然而,当用In-Fusion克隆进行实验时,该方法对于单片段插入和多片段插入反应都是高效的,并且在较短的时间内完成,操作步骤也更少。
 
【用户感言】
“总之,与传统的基于连接酶的克隆方法相比,无论单片段还是多片段克隆,In-Fusion HD克隆试剂盒都为我们提供了更高的克隆效率和更快的结果。”
-Dr. Samuel Bru
 
 
【实验结果】
对于In-Fusion克隆,设计引物使插入片段具有与相邻DNA片段重叠的末端(插入片段和载体之间或插入片段与片段之间,参见图1)。对于连接酶的克隆方法,设计插入片段与相邻片段具有相容的限制酶位点(插入片段和载体之间或插入片段与片段之间。所有插入片段都需要进行PCR扩增和纯化,但使用连接酶方法时,插入片段在克隆前需要用合适的限制酶进行消化。
对每种克隆方法都设置了一个、两个或三个插入片段的克隆反应(参见图1和图2),设计克隆两个和三个插入片段的反应时,所有DNA片段是一步法克隆到表达载体中。在所有实验中,最终质粒均为~6.8 kb。通过限制酶消化鉴定阳性克隆,进行5次独立实验,从10个随机选择的克隆中阳性克隆的数量取平均数以确定克隆效率(图2)。
In-Fusion克隆在所有测试条件下都是成功的,单个和多个插入片段实验都可以得到高克隆效率。相比之下,连接酶方法克隆效率较低,特别是多片段克隆反应。
 
图1. 使用In-Fusion克隆和基于T4 DNA连接酶的方法进行单片段和多片段克隆反应的示意图。插入片段以线性形式显示; 载体以环形显示。In-Fusion克隆所需的相邻DNA片段(插入片段和载体之间或插入片段与片段之间)之间的15 bp重叠以不同的颜色显示。在传统连接酶方法的情况下,颜色代表不同的粘性末端。
 
 
 
图2. 使用In-Fusion克隆和基于连接酶的克隆方法进行单片段和多片段克隆反应的克隆效率定量比较。图A.所有三种克隆反应类型的平均克隆效率的柱型图。结果对应于五个独立实验的平均值±SEM。星号表示使用Mann-Whitney U检验计算的显著差异,***表示p值<0.0005。 图B.对于五个单独的实验中的每一个列出了克隆效率,并且列出了每种克隆反应类型的平均效率。
 
【结论】
In-Fusion技术在单片段插入和多片段插入克隆实验中,结果均优于传统的基于连接酶的克隆方法。虽然连接酶方法对单片段插入的克隆效率为76%,但多片段克隆的效率显著下降,两个和三个片段克隆反应效率分别为2%和0%。相比之下,In-Fusion克隆对于单片段克隆的效率为96%,并且对于双片段和三片段克隆也显示出良好的克隆效率,分别为78%和42%。总体而言,就效率、步骤数和所有三种反应类型的处理时间而言,In-Fusion技术被证明是一种更简单、更快速的克隆方法。
 
 
 
详细实验方法和步骤请见:
https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/single-and-multiple-insert-cloning