Takara

标准流程（Code No. R026A/B）

1. 按下表所示制备反应液

试剂	使用量	终浓度
2×One Step High Fidelity Buffer	25 μl	1 ×
PrimeScript II RT Enzyme Mix	1 μl
PrimeSTAR GXL for 1 step RT-PCR	4 μl
上游 Primer（20 μM）（sense）	1 μl	0.4 μM
下游Primer（20 μM）antisense）	1 μl	0.4 μM
Template RNA^*1	^*1
RNase Free dH2O	up to 50 μl

*1 使用total RNA时推荐加量10～1000 ng。
使用Positive Control RNA时加1 μl。

2. 制备好的反应管置于Thermal Cycler, 选择合适的程序进行RT-PCR。

常用的反应条件

45℃^*2 10 min

94℃ 2 min

↓

98℃ 10 sec

30 cycles

60 or 55℃^*3 15 sec

68℃ 10 sec/kb^*4

*2 反转录反应温度
使用PrimeScript II RTase(PrimeScript II RT Enzyme Mix中含有)可以提高反应特异性，使用特异性下游引物进行反转录反应时，可在45°C进行反转录反应，不会引起RNA的降解及酶的失活。扩增超过6 kb的长链DNA时，通过将反转录反应时间延长至15分钟，可以提高cDNA的合成量。
*3 退火温度
引物的Tm值（按以下公式计算）在55℃以上时，设定为60℃
引物的Tm值（按以下公式计算）在55℃以下时，设定为55℃
※Tm值计算方法
Tm值（℃）＝［（A、T数）×2］＋［（G、C数）×4］－5

*4 延伸时间按照1 kb用时10 sec设定。但是，不足1 kb时设定为10 sec.