| |
| 含有复杂结构的目的基因的扩增
|
|
| |
| ■ 方法 |
| Target：GFR II 基因516 bp（GC含量63.5%） |
| 样 品：人骨骼肌来源的全RNA 5 μg/RT液20 μl |
| |
| 反转录反应液的制备 |
| |
| 试剂 |
使用量 |
| 2×Bca 1st Buffer |
10 μl |
| MgSO4 (25 mM) |
4 μl |
| dNTP Mixture（10 mM） |
1 μl |
| RNase Inhibitor |
0.5 μl |
| BcaBEST polymerase |
1 μl |
| Oligo dT Primer |
1 μl |
| 样品RNA |
1 μl |
| RNase Free dH2O |
1.5 μl |
| Total |
20 μl |
|
|
| |
| 反转录反应条件 |
| |
| 65℃ |
1 min |
1 cycle |
| 30℃ |
5 min |
| ↓ |
15 min |
| 65℃ |
15 min |
| 98℃ |
5 min |
| 5℃ |
5 min |
|
|
| |
| |
| PCR反应 |
| |
| A法（普通方法） |
| 试剂 |
使用量 |
| MgSO4 (25 mM) |
6 μl |
| 5 × Bca 2nd Buffer |
16 μl |
| Bca-Optimized Taq |
0.5 μl |
| 上游PCR引物 |
1 μl |
下游PCR引物 |
1 μl |
| 灭菌水 |
55.5 μl |
| Total |
80 μl |
|
|
| |
| B法 |
| 试剂 |
使用量 |
| MgSO4 (25 mM) |
6 μl |
| 2×Bca1st Buffer |
40 μl |
| Bca-Optimized Taq |
0.5 μl |
| 上游PCR引物 |
1 μl |
下游PCR引物 |
1 μl |
| 灭菌水 |
31.5 μl |
| Total |
80 μl |
|
|
| |
| 分别添加上述反应液（80 μl）和反转录反应后的产物（20μl）按照以下条件进行PCR反应。 |
| |
| PCR反应条件 |
| |
| 94℃ |
1 min |
|
| 94℃ |
30 sec |
40 cycles |
| 60℃ |
30 sec |
| 72℃ |
1 min |
| 72℃ |
5 min |
|
|
|
| |
| ■ 结果 |
| 使用A法（普通方法）未能得到扩增产物，但使用B法能够得到扩增产物。 |
| |
 |
| |
| |
京公网安备 110114000405号