Takara

标准操作流程
BcaBEST^™ RNA PCR Kit Ver.1.1

■ 操作流程

A. 反转录反应

1. 按下表所示制备反应液。

试剂	使用量	终浓度
MgSO4 (25 mM)	2 μl	5 mM
2×Bca 1st Buffer	5 μl	1 ×
RNase Free dH2O	0.75 μl
dNTP Mixture（各10 mM）	0.5 μl	0.5 mM
RNase Inhibitor	0.25 μl	1 U/μl
BcaBEST polymerase(22 U/μl)	0.5 μl	1.1 U/μl
Random 9 mers or Oligo dT Primer or 特异性下游PCR Primer (R-1 Primer)	0.5 μl	2.5 μM or 0.125 μM or 1 μM
Positive Control RNA or 实验样品 RNA	0.5 μl	［1 ×10⁵ copies］ or ［≤500 ng total RNA］
Total	10 μl/sample

* 实验样品是表达量低的RNA时，样品体积可增至1.25 μl。

2. A. -1中反应液充分混合后，加入矿物油覆盖。

（使用TaKaRa Thermal Cycler Dice、GP、SP、MP、PERSONAL时不需要添加）
反应用引物可以使用Random 9 mers、Oligo dT Primer、特异性下游PCR引物（Positive control RNA时使用Control R-1 Primer ）中任意一个。

制备完成的反应管置于Thermal Cycler中，按下述程序进行反应。

B. PCR反应

1. 按下表所示制备反应液。

试剂	使用量	终浓度
MgSO4 (25 mM)	3 μl	2.5 mM
5 × Bca 2nd Buffer	8 μl	1 ×
Bca-Optimized Taq	0.25 μl	12.5 U/50 μl
上游PCR引物（20 μM）（Control RNA使用F-1 Primer）	0.5 μl	0.2 μM
下游PCR引物（20 μM） (Control RNA时使用R-1 Primer)	0.5 μl	0.2 μM
灭菌水	27.75 μl
Total	40 μl/sample

1'. 按上述条件反应进行扩增时如未得到扩增产物，可以尝试使用以下的反应组成，可以改善条件。

试剂	使用量	终浓度
MgSO4 (25 mM)	3 μl	2.5 mM
2 × Bca 1st Buffer	20 μl	1 ×
Bca-Optimized Taq	0.25 μl	12.5 U/50 μl
上游PCR引物（20 μM）	0.5 μl	0.2 μM
下游PCR引物（20 μM）	0.5 μl	0.2 μM
灭菌水	15.75 μl
Total	40 μl/sample

2. 取1.的反应液40 μl加入到A-2.反转录结束的反应管中。
3. 轻微离心约10秒钟。
4. 制备好后的反应管置于Thermal Cycler中，使用合适的程序进行扩增。

常用的反应条件

94℃	30 sec	25～30 cycles
37～65℃	30 sec
72℃	1～10 min
72℃	5 min

Positive Control RNA反应条件

94℃	30 sec	28 cycles
60℃	30 sec
72℃	1 min

5. 反应结束后，取部分反应液（5～10 μl）进行凝胶电泳，确认反应产物。
PCR反应产物至分析使用前冷冻保存。

■ Positive Control RNA的扩增产物大小

反转录反应用引物	PCR primers	扩增片段
Oligo dT Primer	Control F-1Primer & Control R-1 Primer	462 bp
Random 9 mers
R-1 Primer