Takara

标准操作流程
TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)

■ 操作注意

以下为使用该试剂盒时的注意事项。使用前请认真阅读

（1）反应液的制备，可制备多次~10次反应量的Master mix（RNase Free dH2O、buffer、dNTP Mixture、MgCl2等的混合液）。通过制备Master mix，能够减少移液时的损失，减少试剂的分注、搅拌次数等，从而防止实验间的数据误差。
（2） Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, AMV-Optimized Taq等酶类的混合请注意轻柔操作，不要产生气泡。此外，吸打前将试剂轻微离心，使其集于反应管的底部。尤其是酶类，由于含有50%的甘油溶液粘度很高，注意小心吸取。
（3）酶类至使用前于-20℃保存，使用后请立即放回－20℃。
（4）为防止Positive Control RNA分解，请尽量避免反复冻融。建议少量分装多管进行保存。另外，请尽量于－70～－80℃保存。
（5）分装试剂时请尽量使用一次性tip，尽量避免样品间的污染。
（6）使用本试剂盒进行反转录反应时，必须使用特异性引物进行，不能使用Random primer或Oligo dT primer。

2. 反应使用的引物可以在Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer、特异性下游PCR引物（Control RNA使用R-1 Primer）任意选择。

■ 各引物的序列

引物名称

序列

Contorol F-1 primer

5'-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3'

Contorol R-1 primer

5'-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3'

■ Positive Control RNA

本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒 (质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kb的pBR322来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因) 为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。

■ 关于RNA样品的制备

想要成功合成cDNA，需要纯度高的RNA样品。因此，需要抑制细胞内含有的RNase作用，此外，实验中使用的器具及溶液也应避免RNase的混入。制备RNA时，为避免实验者的汗液及唾液中含有的RNase混入，实验过程中请尽量避免讲话，并戴好干净的一次性手套，尽量在RNA专用实验台中操作。

[器具]

关于实验器具，尽量使用一次性的塑料制品。常用的玻璃器具按照下述方法处理后再使用。
（1）玻璃器具在0.1%DEPC溶液中，37℃处理12小时。
（2）为去除残存的DEPC，高压灭菌（120℃、30分钟）。
建议RNA实验中用到的器具（塑料制品及玻璃制品），与其他的器具分开放置，作为RNA专用器具。

[试剂]

实验中用到的试剂溶液，使用干热灭菌（180℃、60分）后的玻璃器具制备，使用的灭菌水请用0.1％DEPC处理并灭菌后使用。RNA实验用到的试剂和灭菌水全部都应专用。

[RNA样品的制备法]

RT-PCR法中用到的RNA样品，通常仅少量的RNA也可以进行实验，所以可以使用简便的纯化方法进行RNA的提取纯化，但是仍建议使用GTC法（Guanidine thiocyanate法）从而得到高度的RNA。
组织、细胞中RNA的提取可以使用NucleoSpin RNA（Code No. 740955.50）或RNAiso Plus（Code No.9108／9109），能够短时间内制备得到高纯度的total RNA。

■ 操作方法

常用RT-PCR例


1. 按以下所示配制反应液
使用One Step RNA PCR Kit时，1次反应使用的RNA样品的最适添加量为1 μg total RNA。

试剂	使用量	终浓度 [反应体系中的加量]
10×One Step RNA PCR Buffer	5 μl	1×
25 mM MgCl2	10 μl	5 mM
10 mM dNTP Mixture	5 μl	1 mM
RNase Inhibitor（40 U/μl）	1 μl	0.8 U/μl
AMV RTase XL（5 U/μl）	1 μl	0.1 U/μl
AMV-Optimized Taq（5 U/μl）	1 μl	0.1 U/μl
上游specific primer^*（20 μM）	1 μl	0.4 μM
下游 specific primer^**（20 μM）	1 μl	0.4 μM
Positive Control RNA	1 μl	total RNA约1 μg
或Experimental Sample^***
RNase Free dH2O	24 μl

合计	50 μl

* 使用Positive Control RNA时：Control F-1 Primer
** 使用Positive Control RNA时：Control R-1 Primer
*** RNA表达量少时：样品最大加量为25 μl

2. 反应液混合后，加入50～100 μl矿物油或AmpliWax覆盖。（使用TaKaRa Thermal Cycler MP或Personal时不需要加）　将准备好的反应管置于Thermal Cycler中，按照下述程序进行反应。
常用的反应条件〈使用Positive Control RNA时〉

50℃〈50℃〉 30 min.〈15 min.〉 RT反应

94℃〈94℃〉 2 min.〈2 min.〉 RT反应

94℃〈94℃〉 30 sec.〈30 sec.〉

PCR反应：25～30 cycles〈28 cycles〉

37～65℃〈60℃〉 30 sec.〈30 sec.〉

72℃〈72℃〉 1～10 min.〈1.5 min.〉

3. 反应结束后、取部分反应液（5～10 μl）进行凝胶电泳，确认反应产物。PCR扩增产物冷冻保存。对照组能够检出462 bp的条带。

■ 关于PCR反应条件

· 退火温度

Control RNA时，使用60℃反应;对于实验样品，可在37～65℃温度范围内对温度进行调整，使其为最适温度。

· 延伸时间

延伸时间依据目的基因的长度设定。通常使用AMV-Optimized Taq时在 72 ℃下每 kb 设定时间在 1～2 min。

· Cycle数

cDNA量较少时，循环圈数可增加至40～50 cycles。