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| 3′-RACE法实验例
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样品RNA：Human HL60 Total RNA
target DNA：Transferrin receptor（TFR）
扩增DNA片段大小：1105 bp |
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| 图3. 3′-RACE法原理图 |
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| A. 反转录反应 |
| ① 按下列组成配制反转录反应液。 |
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| 试剂 |
使用量 |
终浓度 |
| MgCl2 |
2 μl |
5 mM |
| 10 × RNA PCR Buffer |
1 μl |
1 × |
| RNase Free dH2O |
4.25 μl |
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| dNTP Mixture |
1 μl |
1 mM |
| RNase Inhibitor |
0.25 μl |
1 U/μl |
| Reverse Transcriptase |
0.5 μl |
0.25 U/μl |
| Oligo dT-Adaptor Primer |
0.5 μl |
0.125 μM |
| HL60 total RNA(1 μg/μl) |
0.5 μl |
0.5 μg/10 μl RT |
| Total |
10 μl/sample |
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| ② 按以下条件进行反转录反应。 |
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| 30℃、10 min |
1 cycle |
| 50℃、30 min |
| 95℃、2 min |
| 5℃、5 min |
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| B. PCR |
| ① 按下表所示制备反应液。 |
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| 试剂 |
使用量 |
终浓度 |
| MgCl2 |
3 μl |
2.5 mM |
| 10×LA PCR Buffer II（Mg+2 Free） |
4 μl |
1 × |
| 灭菌水 |
31.75 μl |
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| TaKaRa LA Taq |
0.25 μl |
12.5 U/50 μl |
| M13 Primer M4 |
0.5 μl |
0.2 μM |
| TFR-1 Primer |
0.5 μl |
0.2 μM |
| Total |
40 μl/sample |
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| ② 把40 μl的B-①的反应液加入到A-②的反转录反应结束后的PCR反应管中，轻轻混匀。 |
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| ③ 按以下条件进行PCR反应。
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| 94℃、30 sec |
30 cycles |
| 55℃、30 sec |
| 72℃、5 min |
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| ④ 反应结束后，取5 μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认得到了1,105 bp的目的扩增产物。 |
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