Takara

长链mRNA（约12 kb）的扩增

样品RNA：人心脏来源mRNA
target：Dystrophin
扩增大小：12 kb

A. 反转录反应

1. 按下表所示制备反应液。

试剂	使用量	终浓度
MgCl2	2 μl	5 mM
10 × RNA PCR Buffer	1 μl	1 ×
RNase Free dH2O	4.5 μl
dNTP Mixture（各10 mM）	1 μl	1 mM
RNase Inhibitor	0.25 μl	1 U/μl
AMV Reverse Transcriptase XL	0.5 μl	0.25 U/μl
Random 9 mers	0.5 μl	2.5 μM
人心脏来源mRNA	0.25 μl	0.25 μg
Total	10 μl/sample

2.配好后的反应管置于Thermal Cycler中，按以下程序进行反应。

(30℃、10 min)	1 cycle
42℃、50 min
70℃、15 min

B. PCR

1. 按下表所示制备反应液。

试剂	使用量	终浓度
MgCl2	3 μl	2.5 mM
10×LA PCR Buffer II（Mg⁺² Free）	4 μl	1 ×
灭菌水	31.75 μl
TaKaRa LA Taq	0.25 μl	12.5 U/50 μl
sense primer和antisense primer	各0.5 μl	各0.2 μM
Total	40 μl/sample

2. 取40 μl 1. 的反应液加入到A. -2. 反转录结束的反应管中。

3. 混和均匀后将反应管置于Thermal Cycler中，按下述程序进行反应。

94℃、30 sec	30 cycles
65℃、15 min

4. 反应结束后、取部分反应液（5 μl）进行电泳确认。能够确认得到目的片段（12 kb）。