Takara

标准操作流程
TaKaRa RNA LA PCR^™ Kit (AMV) Ver.1.1

■ 操作流程

（1）反转录反应

1. 按下表所示制备反应液。

试剂	使用量	终浓度
MgCl2	2 μl	5 mM
10 × RNA PCR Buffer	1 μl	1 ×
RNase Free dH2O	4.25 μl
dNTP Mixture（各10 mM）	1 μl	各1 mM
RNase Inhibitor	0.25 μl	1 U/μl
AMV Reverse Transcriptase XL^*1	0.5 μl	0.25 U/μl
Random 9 mers or Oligo dT-Adaptor Primer or 特异性下游PCR Primer (R-1 Primer)	0.5 μl	2.5 μM or 0.125 μM or 1 μM
Positive Control RNA or Experimental Sample	0.5 μl	［1 ×10⁵ copies］ or ［≤500 ng total RNA］
Total	10 μl/sample

*1 由于AMV Reverse Transcriptase XL结合在cDNA上，如果直接进行PCR反应，会对PCR反应产生阻害作用。使用（1）-1的反应液时，99℃，5分钟使AMV Reverse Transcriptase XL失活，消除对于PCR反应的阻害。如果Reverse Transcriptase的浓度增加，失活将会变得困难，因此，对于长链RNA进行反转录反应时，不要增加Reverse Transcriptase的量，建议延长反应时间。

2. 反应使用的引物可以在Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer、特异性下游PCR引物（Control RNA使用R-1 Primer）任意选择。

反应液制备完成后将反应管放于Thermal Cycler中，按照下述程序进行反应。

(30℃、10 min)^*2	1 cycle
42～60℃^*3、15 min～30 min
99℃、5 min^*4
5℃、5 min

*2 使用Random 9 mers时，先进行30℃保温10 min，使Random 9 mers与样品RNA在42～60℃充分退火延伸达到足够长度。
*3 AMV来源的Reverse Transcriptase在60℃也可以进行反转录反应。但是如果高温时反应性不好时，建议使用42℃左右的温度进行反应。
*4 扩增长链时，为避免在1st strand cDNA中产生nick，请70℃处理15 min使其失活。

（1）PCR反应

1. 按下表所示制备反应液。

试剂	使用量	终浓度
MgCl2	3 μl	2.5 mM
10×LA PCR Buffer II（Mg⁺² Free）	4 μl	1 ×
灭菌水	31.75 μl
TaKaRa LA Taq	0.25 μl	12.5 U/50 μl
上游PCR引物（Control RNA使用F-1 Primer）	0.5 μl	0.2 μM
下游PCR引物^*5 ［Control RNA使用R-1 Primer、或M13 M4 Primer (反转录使用Oligo dT-Adaptor Primer时)］	0.5 μl	0.2 μM
Total	40 μl/sample

*5 反转录反应时如使用了特异性下游PCR引物，可用0.5 μl灭菌水代替下游PCR引物。

2 将上述1.中的40 μl反应液添加到（1）-2.的反转录反应完成的反应管中。
3. 轻微离心10秒钟。
4. 反应液制备完成后将反应管放于Thermal Cycler中，选择合适的程序进行扩增。

94℃、2 min	1 cycle
94℃、30 sec	25～35 cycles
55～65℃、30 sec
72℃、X min^*6

*6 按照约 1 kb/1 min设置。
引物Tm值高时，shuttle PCR (2 step PCR)也可以。

94℃、2 min	1 cycle
94℃、30 sec	25～35 cycles
65～68℃、 X min^*6	25～35 cycles

*6 68℃时，按照约1 kb/1 min设置。

5 反应结束后，取部分反应液（5～10 μl）电泳，确认反应产物。至PCR扩增产物分析前冷冻保存。

表1 使用Control RNA得到的扩增片段（bp）

反转录反应用引物	PCR primers	扩增片段
Oligo dT-Adaptor Primer	F-1和M13 Primer M4 或F-1和R-1	约1.2 kb 462 bp
Random 9 mers	F-1和R-1	462 bp
Control R-1 Primer	F-1和R-1	462 bp

图1 Positive Control RNA：使用各引物扩增时的片段

■ PCR条件

· 退火温度

使用Positive Control RNA时60℃反应，实际样品的反应条件不同。长链扩增多使用长度为25 mer左右的引物，因此通常在55～65℃的范围内研讨适宜反应温度。

· 延伸时间

延伸时间需根据target的长度设置。通常设置为68～72℃约1 kb/min。

· 循环圈数

cDNA量较少时，循环圈数可增加至40～50 cycles。