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反转录反应中引物的选择、RNA样品的制备、操作注意事项

1. 关于反转录引物的选择

用于反转录的引物可视实验具体情况选择Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer或特异性下游引物。对于不具有Hairpin构造的短链mRNA，3种引物中的任何一种都可以使用，但一般应按以下方法进行选择。

Random 9 mers	适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。用Random 9 mers合成的cDNA进行PCR反应时，使用任何一对特异性引物都能获得良好的扩增。
Oligo dT Primer	适用于具有Poly(A)+ Tail的RNA。（注意：原核生物的RNA、真核生物的rRNA及tRNA以及某些种类的真核生物的mRNA 不具有Poly(A)+Tail）。本Primer设计巧妙，反转录效率高。反转录反应后，可用M13 Primer M4进行3’-RACE实验。
特异性下游PCR Primer （PCR时的下游引物）	因其必须与模板序列互补，所以只适用于Target序列已知的情况。

2. RNA样品制备

本试剂盒是把RNA合成cDNA，然后再对此cDNA进行扩增的试剂盒。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。

【使用器具】

尽量使用一次性塑料器具。若使用玻璃器具，应在使用前按下列方法进行处理。

（1）用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。
（2）然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。

RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。

【试剂配制】

用于RNA实验的试剂，包括蒸馏水，须使用干热灭菌（180℃，60 min.）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的灭菌水须用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。

RNA实验用的试剂和灭菌水都应专用，避免混用后交叉污染。

【制备方法】

使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RT-PCR反应的RNA（只需少量的RNA便可进行RT-PCR反应）。但为了保证实验的成功率，建议使用GTC法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度RNA。

【RNA样品量】

使用本试剂盒进行RT-PCR反应时，每次反应所需的最适Total RNA量约为500 ng。

3. 使用注意

以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。

1). 当同时需要进行多个反转录反应或PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液 (其中包括RNase Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture、MgCl2等），然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。
2) 使用Reverse Transcriptase（AMV）、RNase Inhibitor、TaKaRa LA Taq酶等酶类时，应轻轻混匀，避免起泡。分取之前要小心地离心收集到反应管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
3) 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回-20℃中保存。
4) 分装试剂时务必使用新的枪头，以防止样品间污染。
5) PCR反应条件
最适的PCR条件因PCR扩增仪的不同而不同，建议在进行样品实验前最好先试做一下Control实验。