Takara

1 Step RT-PCR标准操作流程

PrimeScript^™ II High Fidelity RT-PCR Kit（Code No.R023A）

1. 按下列组成配制PCR反应液。

试剂	使用量	终浓度
5×PrimeSTAR GXL Buffer	10 μl	1×
dNTP Mixture（10 mM each）	1 μl	200 μM
PrimeScript II RT Enzyme Mix	1 μl
PrimeSTAR GXL for RT-PCR	2 μl
上游Primer（20 μM）^*1	1 μl	0.4 μM
下游Primer（20 μM）^*2	1 μl	0.4 μM
Template RNA^*3	*3
RNase Free dH2O	up to 50 μl

*1 Positive Control RNA使用F-1 Primer。
*2 Positive Control RNA使用R-1 Primer。
*3 建议Total RNA的使用量范围在10~1,000 ng之间，Positive Control RNA为模板时使用量为1 μl。

2. 反应条件

【一般实验的PCR反应条件】

45℃^*4 30 min.

94℃ 2 min

↓

98℃ 10 sec.

30 cycles

98℃ 10 sec.

30 cycles

60 or 55℃^*5 15 sec.

68℃ 1 min./kb

【Positive Control RNA的PCR反应条件】 Control反应可确认到462 bp的扩增片段。

45℃ 30 min.

94℃ 2 min

↓

98℃ 10 sec.

30 cycles

60℃ 15 sec.

68℃ 1 min.

*4 反转录反应温度
使用PrimeScript II RTase（PrimeScript II RT Enzyme Mix中含有）可以提高反应特异性，使用特异性下游引物进行反转录反应时，可在45℃进行反转录反应，不会引起RNA的降解及酶的失活。
*5 退火温度
引物的Tm值（按下述公式计算）在55℃以上时，设定为60℃；引物的Tm值在55℃以下时，设定为55℃。
Tm 值计算方法
Tm 值（℃）＝[（A、T数）× 2 ]＋[（G、C数）× 4 ]－5

【PCR反应条件的选择】

■ 请先尝试使用3 Step PCR。

■ 使用GC rich模板时推荐使用2 Step PCR法。

上述反应条件下扩增效率不良时，请进行如下研讨：

＜扩增产物出现Smear及非特异性扩增时＞

① 将退火温度每次间隔2℃上升至63℃。
② 使用2 Step PCR。
③ 引物的Tm值在50℃以下时，退火温度尝试在50～55℃之间选择。

＜无扩增产物或扩增产物少时＞

① 模板使用量根据推荐量来添加。
② 增加PCR循环圈数至40~50 Cycles。
③ 尝试每次间隔2℃下降退火温度。

* 使用PrimeSTAR GXL进行RT-PCR反应时不能用dUTP替代dTTP（反应效果明显下降）。此外，请尽量避免使用含有次黄嘌呤的引物。