Takara

2 Step RT-PCR标准操作流程

PrimeScript^™ II High Fidelity RT-PCR Kit（Code No.R023A）

A. 模板RNA的变性及反转录反应

1. 在Microtube管中配制下列混合液。

试剂		使用量
dNTP Mixture（10 mM each）		1 μl
Oligo dT Primer（50 μM） or Random 6 mers（20 μM） or Specific Primer（2 μM）^*1		1 μl
Template RNA^*2 (Positive Control RNA [4×105 copies])		2 μl
RNase Free dH2O		up to 10 μl

*1 合成cDNA的引物可结合实际情况从Oligo dT Primer、Random 6 mers、Specific Primer中任选一种，请参照说明书中【2 Step RT-PCR时引物的选择】。
*2 Template RNA最多可加至8 μl，当使用Total RNA时，最多可加至6 μg（推荐使用量：100 ng～2 μg）。

2. 在PCR仪上进行变性、退火反应。

50℃ 30 min.

4℃

<重要> 该操作使模板RNA变性，提高反转录效率。

3. 在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

试剂	使用量
上述变性、退火后反应液	10 μl
5×PrimeScript II Buffer	4 μl
PrimeScript II RT Enzyme Mix	1 μl
RNase Free dH2O	5 μl
	20 μl

4. 在PCR仪上按下列条件进行反转录反应。

(30℃ 10 min)^*3

42℃（～50℃） 15～30 min

95℃ 5 min^*4

4℃

<重要> 因PrimeScript II RTase对具有复杂结构的模板同样具有良好的延伸性能，通常可在42℃下进行反应。使用特异性下游引物进行反转录反应时，有时会因引物错配而产生非特异性扩增。此时将温度在45℃~50℃范围内调整，可能会减少非特异性扩增。

*3 反转录反应引物为Random 6 mers时，进行此操作可使Random 6 mers在42℃（～50℃）和模板RNA充分退火、延伸，增加反转录效率。
*4 进行长片段DNA扩增时，为了避免破损1st cDNA链，请进行70℃、15 min的失活反应。

B. PCR反应

1. 按下列组成配制PCR反应液。

试剂	使用量	终浓度
5×PrimeSTAR GXL Buffer	10 μl	1×
dNTP Mixture（10 mM each）	1 μl	200 μM
上游Primer（20 μM）^*5	0.5 μl	0.2 μM
下游Primer（20 μM）^*6	0.5 μl	0.2 μM
PrimeSTAR^® GXL for RT-PCR	2 μl
上述的反转录反应液	≤5 μl
灭菌水	up to 50 μl

*5 Positive Control RNA使用F-1 Primer。
*6 Positive Control RNA使用R-1 Primer。

2. 反应条件

【一般实验的PCR反应条件】

98℃ 10 sec.

30 cycles

98℃ 10 sec.

30 cycles

55 or 60℃^*7 15 sec.

68℃ 1 min./kb

【Positive Control RNA的PCR反应条件】^*8

98℃ 10 sec.

30 cycles

60℃ 15 sec.

68℃ 1 min.

*7 退火温度
引物的Tm值（按下述公式计算）在55℃以上时，设定为60℃；引物的Tm值在55℃以下时，设定为55℃。
Tm 值计算方法
Tm 值（℃）＝[（A、T数）× 2 ]＋[（G、C数）× 4 ]－5
*8 反转录反应中使用Oligo dT Primer、Random 6 mers、R-1 Primer中的任何一种引物，PCR反应使用Control F-1 Primer/Control R-1 Primer时扩增片段大小均为462 bp。

【有关PCR反应条件的说明】

■ 扩增片段＜8 kb时，请先尝试使用3 Step PCR。

■ 使用GC rich模板及扩增片段＞8 kb时，推荐使用2 Step PCR法。

上述反应条件下扩增效率不良时，请进行如下研讨：

＜扩增产物出现Smear及非特异性扩增时＞

① 将退火温度每次间隔2℃上升至63℃。
② 使用2 Step PCR。
③ 引物的Tm值在50℃以下时，退火温度尝试在50～55℃之间选择。

＜无扩增产物或扩增产物少时＞

① 尝试每次间隔2℃降低退火温度。
② 合适的引物终浓度在0.3～0.5 μM之间选择。
使用PrimeSTAR GXL进行RT-PCR反应时，不能用dUTP替代dTTP（反应效果明显下降）。此外，请尽量避免使用含有次黄嘌呤（I）的引物。