Takara

PrimeScript^™ RT-PCR Kit的实验操作（Code No.RR014A）

A. Template RNA变性及反转录反应

A-1 配制下列反应混合液

试剂	使用量
dNTP Mixture（10 mM each）	1 μl
Oligo dT Primer（2.5 μM） or Random 6 mers（20 μM） or Specific Primer（2 μM）^*1	1 μl
Template RNA^*2 or Positive Control RNA	[4×10⁵ copies]
RNase Free dH2O	up to 10 μl

*1 合成cDNA的引物可结合实际情况从Oligo dT Primer、Random 6 mers、Specific Primer中任选一种（对于Control RNA，使用R-1 Primer）。

*2 Template RNA最多可加至8 μl，当使用Total RNA时，最多可加至5 μg (推荐使用量：100 pg～1 μg)。

A-2 在PCR仪上进行变性、退火反应

65℃ 5 min

4℃

NOTE：变性、退火操作有利于模板RNA的变性以及反转录引物和模板的特异性退火，可提高反转录反应效率。

A-3 在上述反应管中配制下列反转录反应液

A-4 在PCR仪上按下列条件进行反转录反应

（30℃ 10 min.）^*3

42℃（～50℃） 15～30 min.

95℃ 5 min.^*4

4℃

*3 反转录反应引物为Random 6 mers时，此操作可使Random 6 mers在42℃ (～50℃) 和模板RNA充分退火、延伸，增加反转录效率。

*4 进行长片段DNA扩增时，为了保证1st strand cDNA完整，请进行70℃、15 min 的失活反应。。

NOTE：PrimeScript RTase对具有复杂二级结构的模板同样具有良好的延伸性能，通常可在42℃下进行反应。使用特异性下游引物进行反转录时，有时会因错配而产生非特异性扩增。此时可将温度升到50℃，可能会减少非特异性扩增。

B. PCR反应

B-1 按下列组成配制PCR反应液

试剂	使用量	Final concentration
10×PCR Buffer Ⅱ	5 μl	1×
dNTP Mixture（10 mM each）	2 μl	400 μM
Upstream Primer（20 μM）^*5（Sense）	0.5 μl	0.2 μM
Downstream Primer（20 μM）^*6（Anti-sense）	0.5 μl	0.2 μM
TaKaRa Ex Taq HS（5 U/μl）	0.5 μl
上述的反转录反应液	≤5 μl
灭菌水	up to 50 μl

*5 Positive Control RNA使用F-1 Primer。

*6 Positive Control RNA使用R-1 Primer。

B-2 按照下面的反应条件进行反应

一般反应条件

（A）三步法PCR的反应条件：

30 cycles

（B）两步法PCR的反应条件：

30 cycles

94℃ 30 sec.

98℃ 10 sec.

55～65℃ 30 sec.

68℃ 1 min./kb

72℃ 1 min./kb

Positive Control RNA^*7的反应条件

94℃ 30 sec.

30 cycles

60℃ 30 sec.

72℃ 1 min

*7 在进行PCR扩增时使用Control Primer F-1和R-1引物，都可以得到462 bp的PCR扩增产物。