Takara

标准操作流程
（TaKaRa PCR Amplification Kit）

[使用TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice时]

A. 对照反应

本试剂盒包含λDNA和扩增λDNA的6,012 bp及500 bp目的序列所需的引物。

1. 按下述所示制备反应液。

	反应液量	终浓度
10 × LA PCR Buffer (Mg²⁺plus)^*	5 μl	［1×］
dNTP Mixture	4 μl	各200 μM
Control Primer1	0.5 μl	0.2 μM
Control Primer2 or 3	0.5 μl	0.2 μM
TaKaRa Taq	0.25 μl	1.25 U/50 μl
Control Template	0.5 μl	0.5 ng/50 μl
灭菌水	39.25 μl
Total	50 μl

* 依需要可以使用10×PCR Buffer（Mg²⁺ free）和MgCl2溶液替代。

2. 将反应管放入TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice中。

3. 按以下条件进行设定。

使用Control Primer 1，2时（扩增6,012 bp）

94℃、1 min（denaturation）	30 cycles
68℃、4 min（annealing and extension）	30 cycles
72℃、5 min	1 cycle

使用Control Primer 1，3时（扩增500 bp）

94℃、30 sec（denaturation）	25 cycles
55℃、30 sec（annealing)
72℃、30 sec（extension)
72℃、2 min	1 cycle

按以上条件对Control Template的目的序列进行扩增。

B. 样品反应

实验过程大致与对照反应相同。
PCR反应一般以变性、退火、延伸3个阶段的温度变化为基础反应，但是当扩增长片段时（≥6kb），将退火与延伸合并进行2个阶段温度变化（shuttle PCR）的反应更适合。
但是，需要按照目的序列大小、引物大小及碱基序列设定变性、退火、延伸各步骤中的适宜条件（温度、时间）。

C. 电泳

反应结束后的溶液取5～10 μl加入1/6量6×Loading Buffer，样品加入到凝胶孔中，进行电泳。凝胶的种类及浓度依DNA的大小、目的不同区分使用。
电泳后的凝胶浸入1μg/ml溴乙锭溶液中20～30分钟，染色后紫外照射确认DNA条带。

操作注意事项

· 将试剂盒中的试剂混匀、离心后使用。注意， TaKaRa Taq需使用移液器轻柔混匀。此外，各试剂至使用前于冰上保存。
· 如果样品DNA中混有蛋白酶污染，可在热变性步骤之后加入TaKaRa Taq。将蛋白酶失活，防止TaKaRa Taq分解。
· 样品DNA的制备方法不同，10×PCR Buffer（Mg²⁺ plus）中Mg²⁺的浓度可能不合适。此时，需要使用10×PCR Buffer（Mg²⁺ free）
改变Mg²⁺浓度进行预实验，以确认适宜的Mg²⁺浓度。