Takara

Control反应的扩增
(TaKaRa LA PCR^™ Kit Ver.2.1)

Control反应

A. LA 篇

本试剂盒作为control包含HT29来源的基因组DNA及扩增约17.5kb区域所需的引物。

1. 按下述所示制备反应液。

	反应液量	终浓度
10×LA PCR Buffer II（Mg²⁺ plus）	5 μl	［1×］
dNTP Mixture	8 μl	各400 μM
Control Primer LA3	1 μl	0.2 μM
Control Primer LA4	1 μl	0.2 μM
TaKaRa LA Taq	0.5 μl	2.5 U/50 μl
Control Template	2 μl	200 ng/50 μl
灭菌水	32.5 μl
Total	50 μl

2. 为防止样品蒸发、使用50 μl矿物油^*或Ampli Wax PCR Gem^**1个覆盖反应液。（使用TaKaRa PCR Thermal Cycler MP 或PERSONAL时不需要）

* 反应结束后如需完全去除矿物油，使用100 μl氯仿进行抽提。
** 如果使用Ampli Wax PCR Gem，不需要进行氯仿抽提。另外，Hot Start法可以自动化。

3. 将反应管置于Thermal Cycler中。

4. 按以下条件进行PCR反应。

98℃	20 sec.^*	30 cycles
68℃	15 min.	30 cycles

* 如果使用的是TaKaRa PCR Thermal Cycler MP，PERSONAL按照下述条件进行PCR反应。

不需要使用矿物油和PCR用Wax。

98℃	10 sec.	30 cycles
68℃	15 min.	30 cycles

5.反应结束后、取部分反应液（5～10 μl）进行凝胶电泳，确认反应产物。使用Control Primer LA时，能确认得到约17.5 kb的条带。

B. GC rich篇

本试剂盒作为Control，包含HT29来源的基因组DNA以及扩增约1,255 bp区域（GC含量65％）所需的引物。

1. 按下述所示制备反应液。

	反应液量	终浓度
2×GC Buffer I或2×GC Buffer II	25 μl	［1×］
dNTP Mixture	8 μl	各400 μM
Control Primer GC1	1 μl	0.2 μM
Control Primer GC2	1 μl	0.2 μM
TaKaRa LA Taq	0.5 μl	2.5 U/50 μl
Control Template	1 μl	100 ng/50 μl
灭菌水	13.5 μl
Total	50 μl

2. 同A.LA篇

3. 同A.LA篇

4. 按以下条件进行PCR反应。
（Thermal Cycler TP2000、TP480、MP、PERSONAL等）

94℃	1 min
94℃	30 sec.	30 cycles
60℃	30 sec.
72℃	2 min.
72℃	5 min.

5.反应结束后、取部分反应液（5～10 μl）进行凝胶电泳，确认反应产物。使用Control Primer GC时，能够确认得到1,255 bp的条带。

操作注意

· 推荐DNA使用量

人基因组DNA

0.1 μg～1 μg/50 μl PCR

大肠杆菌基因组DNA

10 ng～100 ng/50 μl PCR

λ噬菌体DNA

0.5 ng～2.5 ng/50 μl PCR

·扩增长链DNA时的反应液体积，建议为10～50 μl。反应液体积大于50 μl时，可能会降低扩增效率。
·扩增长链DNA时用的引物，需设计为高特异性引物。为提高特异性，引物为30～35 mer时效果较好。
·模板DNA尽量使用纯度较高的样品。此外，扩增长链DNA时的模板DNA量，通常为一般PCR时的4～5倍量。
·试剂盒中的试剂恢复至室温～37℃并完全溶解后，使用移液器或将反应管上下颠倒使其充分混匀。请尽量避免vortex。混匀10×LA PCR Buffer（以及2×GC Buffer）、TaKaRa LA Taq时，操作时请注意不要产生气泡以避免引起酶失活。另外，试剂盒中各试剂至使用前于冰上保存。

·反应开始前，轻轻吸打混匀反应液。此时，注意一定不要使用vortex。
·如果样品DNA有蛋白酶污染，先进行热变性操作（denaturation step），之后加入TaKaRa LA Taq。通过热失活蛋白酶能够防止TaKaRa LA Taq的降解。