Takara



LA PCR时模板DNA的制备例


TaKaRa LA Taq（Code No. RR002A）

模板DNA的状态是能否准确进行LA PCR的关键因素之一。对超过10 kb的片段进行扩增反应时，使用简单方法（比如细胞热处理或只经蛋白酶处理）制备的样品DNA不适合作为模板。理想的是使用充分纯化后的完整的DNA（不含nick等）。

（1）人基因组DNA的制备例
1. 从15个Petri培养皿中收集HL60细胞（1.5×10⁹ cells），使用0.7％的NaCl溶液清洗2次。 2. 用15 ml 10 mM Tris-HCl（pH8.3）重悬细胞。 3. 在细胞悬液中加入150 μl的10 mg/ml 的Proteinase K和150 μl 10％的SDS，60℃孵育1小时后，再在37℃孵育16小时。 4. 将15 ml的0.1 M Tris-HCl（pH8.0）饱和的苯酚加入上述溶液中，轻轻混合15分钟。 5. 9,000 rpm（约6,000×g）离心10分钟。 6. 将上清（水相）转移到另一个反应管中，加入15ml TE Buffer（pH9.0）饱和的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻柔混匀15分钟。 7. 9,000 rpm（约6,000×g）离心10分钟。 8. 将上清（水相）转移到新的反应管中，加入15ml 氯仿/异戊醇（24:1），将反应管上下颠倒轻柔混匀15分钟。 9. 9,000 rpm（约6,000×g）离心10分钟。 10. 将上清（水相）转移到新的反应管中，加入1.5 ml 3 M醋酸钠（pH5.2）和30 ml乙醇，轻柔混匀。 11. 使用细玻璃棒将DNA缠于玻璃棒上。 12. 80％乙醇清洗，干燥。 13. 将DNA溶于10 ml的TE Buffer中（将缠有DNA的细玻璃棒置于TE buffer中，4℃放置一夜），加入100 μl 10 mg/ml的RNaseA，37℃孵育1小时。 14. 加入10 ml 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀5分钟。 15. 9,000 rpm（约6,000×g）离心10分钟。 16. 将上清（水相）转移到新的反应管中、加入10 ml氯仿/异戊醇（24：1），轻轻颠倒混合5分钟。 17. 9,000 rpm（约6,000×g）离心5分钟。 18. 将上清（水相）转移到新的反应管中，加入1 ml 3 M醋酸钠（pH5.2）和20 ml乙醇，轻轻混匀。 19. 细玻璃棒缠绕回收DNA。 20. 80％乙醇清洗，干燥。 21. 用2 ml的TE Buffer溶解DNA（将缠有DNA的细玻璃棒置于Buffer中、4℃放置一晚）、调整其终浓度为0.5 mg/ml。

（2）大肠杆菌基因组DNA制备例
1. 将2瓶过夜培养的200 ml大肠杆菌LB培养液离心收集菌体，使用40 ml buffer（50 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、pH8.0）悬浮细胞。 2. －80℃冷冻30分钟。 3. 加入4 ml 0.25 M Tris-HCl（pH8.0）溶解的终浓度为10 mg/ml的溶菌酶至冷冻菌液中，室温下边混匀边溶融化。溶化后冰上静置45分钟。 4. 加入8 ml STEP〔0.5％ SDS、50 mM Tris-HCl（pH8.0）、0.4 M EDTA、1 mg/ml Proteinase K〕，50℃孵育1小时。 5. 加入45 ml TE Buffer〔10 mM Tris-HCl（pH8.3）、1 mM EDTA〕，然后再加入96 ml TE Buffer pH9.0饱和的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），上下颠倒轻轻混合5分钟。 6. 5,000 rpm（约4,000×g）离心15分钟。 7. 将上清（水相）转移到新的离心管中，加入96 ml 氯仿/异戊醇（24：1），将反应管上下颠倒轻轻混合5分钟。 8. 5,000 rpm（约4,000×g）离心15分钟。 9. 将上清（水相）转移到新的离心管中，加入9 ml 3 M醋酸钠（pH5.2）和225 ml乙醇、轻轻颠倒混合。 10. 将DNA缠于细玻璃棒上，回收。 11. 80％乙醇冲洗、晾干。 12. 将DNA溶解于20 ml的TE Buffer （将缠有DNA的玻璃棒置于4℃ Buffer中，放置一夜。）、加入10 μl 10 mg/ml 的RNaseA，37℃孵育30分钟。 13. 加入20 ml上述苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），将反应管上下轻轻颠倒混匀。 14. 10,000 rpm（约7,500×g）离心15分钟。 15. 将上清（水相）转到新的反应管中，加入20ml 氯仿/异戊醇，将反应管上下颠倒混匀5分钟。 16. 10,000 rpm（约7,500×g）离心15分钟。 17. 将上清（水相）转移到新的反应管中，加入2ml 3 M醋酸钠（pH5.2）和50 ml的乙醇，轻轻上下颠倒混匀。 18. 用细玻璃棒将DNA缠绕回收。 19. 80％乙醇冲洗、晾干。 20. 用20 ml的TE Buffer溶解DNA （将缠有DNA的玻璃棒置于Buffer中4℃放置一夜），调整终浓度为0.1 mg/ml。 Takara销售使用上述方法制备的DNA（用作Control Template）。（LA PCR? Genome DNA Set：Code No. 9060）

■ 推荐DNA使用量
人基因组DNA	0.1μg～1 μg/50 μl PCR
大肠杆菌基因组DNA	10 ng～100 ng/50 μl PCR
λ噬菌体DNA	0.5 ng～2.5 ng/50 μl PCR