TaKaRa Taq™ HS PCR Kit, UNG plus的操作方法 | |||
1. 在冰上配制反应液 除模板(检测样品)外,将下列组份根据反应所需份数配制混合液,分装到反应管中,盖上反应管盖。 |
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TaKaRa Taq HS (5 U/μl) | 0.25 μl | ||
10×PCR Bufferfor UNG plus | 5 μl | ||
dU plus dNTP Mixture | 4 μl | ||
UNG | 0.5 μl | ||
Template | < 500 ng | ||
Primer 1 | 10~50 pmol (终浓度0.2~1.0 μM) | ||
Primer 2 | 10~50 pmol (终浓度0.2~1.0 μM) | ||
灭菌水 | Up to 50 μl | ||
2. 模板(样品)的添加。 向1.的分装后反应液中添加模板(样品),盖紧反应管盖。 |
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3. 轻微离心,将反应管放置到PCR扩增仪中。 | |||
4. UNG处理及PCR扩增。 先进行UNG处理,然后使UNG失活。随后按照PCR反应条件进行PCR扩增。根据扩增片段大小设定PCR反应条件。 |
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<例如扩增1 kb DNA片段时> | |||
25℃ 10 分钟(UNG处理)*1 | |||
95℃ 2 分钟(UNG的热失活)*1 | |||
98℃ 10 sec. *2 | 30 Cycles | ||
55℃ 30 sec. | |||
72℃ 1 min. *3 | |||
*1 UNG酶处理条件不变,与扩增片段大小无关。 *2 PCR变性条件请根据PCR扩增仪种类及反应管种类进行设定。一般设定为98℃ 5~10 秒或94℃ 20~30 秒。 *3 使用dUTP替代dTTP,有时PCR扩增效率会有所下降,当扩增效率不良时,请延长延伸时间。 |
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5. 将PCR扩增产物进行凝胶电泳等分析。 | |||