Takara



TaKaRa Taq Hot Start Version（Code No. R007A/B）的操作方法



1. 在冰上按下列组份配制反应液。除模板（检测样品）外，将下列组份根据反应所需份数配制混合液，分装到反应管中，盖上反应管盖。

TaKaRa Taq Hot Start Version (5 U/μl)		0.25 μl
10×PCR Buffer (Mg²⁺ plus)		5 μl
dU plus dNTP Mixture^*2		4 μl
MgCl2^*2，3		1.5 μl
UNG^*2，4		0.5 μl
Template		< 500 ng
Primer 1		10～50 pmol （终浓度0.2～1.0 μM）
Primer 2		10～50 pmol （终浓度0.2～1.0 μM）
灭菌水		Up to 50 μl

1 TaKaRa Taq* Hot Start Version（Code No. R007A/B）中的附带试剂。 2 TaKaRa PCR Carryover Prevention Kit中的试剂。 3 因dUTP的浓度设定是dTTP的3倍，所以总体dNTP的浓度变高，虽然PCR Buffer中含有MgCl2，但为了保持MgCl2与dNTP量的平衡，要增加MgCl2浓度。使用10 × PCR Buffer (Mg⁺² free) 时请添加4.5 μl MgCl2。 *4 标准使用量：50 μl反应体系中添加1 U。

2. 模板（样品）的添加。向1.的分装后反应液中添加模板（样品），盖紧反应管盖。

3. 轻微离心，将反应管放置到PCR扩增仪中。

4. UNG处理及PCR扩增。先进行UNG处理，然后使UNG失活。随后按照PCR反应条件进行PCR扩增。根据扩增片段大小设定PCR反应条件。

<例如扩增1 kb DNA片段时>
25℃?? 10 分钟（UNG处理）^*1
95℃?? 2 分钟（UNG的热失活）^*1
98℃ 10 sec.^*2	30 Cycles
55℃ 30 sec.
72℃ 1 min.^*3
1 UNG酶处理条件不变，与扩增片段大小无关。 2 PCR变性条件请根据PCR扩增仪种类及反应管种类进行设定。一般设定为98℃ 5～10 秒或94℃ 20～30 秒。 *3 使用dUTP替代dTTP，有时PCR扩增效率会有所下降，当扩增效率不良时，请延长延伸时间。

5. 将PCR扩增产物进行凝胶电泳等分析。