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Protocols

MightyAmp^™ Genotyping Kit操作流程（Code No. R074A）

A．从组织材料中提取DNA（在室温下操作）

1. 将组织材料^*1放入已加入100 μl Extraction Buffer的PCR Tube中。
【注意】Extraction Buffer出现沉淀时，加热至60℃，缓慢搅拌溶解。

2. 将1 μl Proteinase K (20 mg/ml)加入到Tube中。

3. 60℃加热5分钟后，98℃再加热2分钟，然后降至室温^*2。

4. 室温下离心，使组织材料沉淀，上清为PCR的模板（Extraction Buffer提取液）^*3。

   *1：组织材料的添加标准
   · 小鼠尾≤2 mm
   · 小鼠耳≤5 mm²
   · 小鼠脏器≤30 mm³
   · 植物的叶≤5 mm²

*2：4℃时会产生沉淀物，操作中请保持室温(25℃)。

*2：需要保存时，将上清移至新的Tube中于-20℃保存。
使用前请将Extraction Buffer提取液溶解至室温，确认溶液中无沉淀物。

B．PCR反应液配制（50 μl反应量）

试剂	使用量	终浓度
2×MightyAmp Buffer	25 μl	1×
Primer 1	15 pmol	0.3 μM
Primer 2	15 pmol	0.3 μM
Extraction Buffer提取液*	≦ 2.5 μl
MightyAmp DNA Polymerase	1 μl	1.25 U/50 μl
灭菌水	Up to 50 μl

* Extraction Buffer提取液必须达到室温后再使用。建议Extraction Buffer提取液的添加量在反应体系的1/20以下。其他试剂使用前请置于冰上。

C．PCR反应条件设定

标准反应条件为3 Step PCR，延伸温度设定为68℃。

[3 Step PCR]

98℃ 2 min*

↓

98℃ 10 sec.

30～40 cycles

60℃ 15 sec.

68℃ 1 min/kb

or

[2 Step PCR]

98℃ 2 min*

↓

98℃ 10 sec.

30～40 cycles

68℃ 1 min/kb

* 使用了抗性非常强的Hot Start酶，在初期变性时必须进行98℃ 2 min.的抗体变性步骤。

D．PCR扩增产物的电泳

· 电泳前将5 × Loading Dye和PCR产物按照1：4比例混合。

· 使用MightyAmp DNA Polymerase扩增得到的PCR产物，电泳时请尽量使用TAE Buffer，使用TBE Buffer有时得不到好的电泳结果。