Takara

T4 Polynucleotide Kinase

T4 Polynucleotide Kinase磷酸化反应体系和条件

1. 使用PCR反应液直接进行DNA片段的5’末端磷酸化反应

① 在微量离心管中配制下列反应液，全量为20 μl。

T4 Polynucleotide Kinase（10 U/μl）	2 μl
ATP（10 mM）	5 μl
10×Reaction Buffer	2 μl
PCR反应液^*	≤ 5 μl
dH2O	up to 20 μl

*PCR反应液使用量应为5 μl以下。

② 37℃反应30分钟。

③ 70℃加热5～10分钟使酶失活。

2. 使用纯化后的双链DNA片段的5’末端磷酸化反应

① 在微量离心管中配制下列反应液，全量为20 μl。

T4 Polynucleotide Kinase（10 U/μl）	2 μl
ATP（10 mM）	5 μl
10×Reaction Buffer	2 μl
双链DNA片段	≤ 10 pmol
dH2O	up to 20 μl

② 37℃反应30分钟。

③ 70℃加热5～10分钟使酶失活。

3. 使用Primer、Linker、Adaptor、Probe的5’末端磷酸化反应

① 在微量离心管中配制下列反应液，全量为10 μl。

T4 Polynucleotide Kinase（10 U/μl）	1 μl
ATP（10 mM）	1 μl
10×Reaction Buffer	1 μl
单链DNA片段	5～10 pmol
dH2O	up to 10 μl

② 37℃反应30分钟。

③ 70℃加热5～10分钟使酶失活。