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| 使用T4 DNA Ligase连接质粒载体和外源片段的实验例 |
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| 1. 配制以下反应体系。 |
| 10×ligation buffer*1 |
2 μl |
| 载体DNA |
50 ng |
| 插入DNA片段 |
(与载体DNA的摩尔比约为3)*2 |
| T4 DNA Ligase (350 U/μl) |
1 μl |
| 灭菌水 |
| Total |
20 μl |
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| 2. 对于粘性末端连接，16℃反应1-5小时；对于平末端连接，16℃反应1-24小时。*3 |
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| 3. 取连接液的一部分用于转化*4。反应液可以在-20℃保存。 |
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| *1 即T4 DNA Ligase (Code No.2011A/B)附带buffer，buffer组成为(660 mM Tris-HCl (pH 7.6), 66 mM MgCl 2, 100 mM DTT, 1 mM ATP) |
| *2 载体与片段的最佳摩尔比根据DNA的大小、载体是否去磷酸化、DNA末端类型不同而变化，建议在1:1-1:10之间进行研讨。 |
| *3 如果连接存在困难，可以延长反应时间。如果长时间进行反应（大于16小时），可以在4℃进行反应。 |
| *4 如果需要进行电穿孔转化等，请在下一步实验前，对反应液进行苯酚抽提、乙醇沉淀。 |
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