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PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase

高保真PCR酶PrimeSTAR系列保真性验证

TaKaRa Bio 公司为了满足广大研究人员的需要提供各种PCR酶。其中PrimeSTAR^®系列以其高保真性和高扩增效率作为「便于使用的高保真酶」受到广大研究人员的好评。在本稿中介绍实际进行的重复序列扩增例及在长链目的基因的特异性位点进行的突变导入例，验证PrimeSTAR^®系列的保真性。

■ 实验例1：与各种PCR 酶的保真性比较（1）

～富含GC 序列的目的基因～

本公司为了验证PCR酶的保真性，选择实际的方法对多个扩增产物测序后比较错配率。扩增的目的基因序列设置在容易导入基因突变的富含GC 序列区域。

【方法】

以富含GC序列并容易发生碱基突变的Thermus thermophiles HB8基因组DNA为模板，任选10个区域（各扩增片段约为500 bp），使用各种PCR酶进行PCR扩增（反应液组份及PCR反应条件使用各酶推荐的操作流程）。将各自PCR扩增产物克隆至载体中，并对每种序列挑取复数的克隆进行测序确认碱基序列。以错配碱基数对总解析碱基数的比率来测定mutant frequency（突变率）。

【结果】

PrimeSTAR^®系列各种PCR酶的扩增产物（约50万个碱基）的测序结果表明，仅10～30个碱基发生了错配。可以看出其保真性优于高保真酶的起源酶Pfu DNA Polymerase（图1）。

图1. PrimeSTAR^® 系列与各种PCR 酶的保真性比较

■ 实验例2：与各种PCR 酶的保真性比较（2）

～重复序列～

本公司为了验证PCR酶的保真性，选择实际的方法对多个扩增产物测序后比较错配率。扩增的目的基因序列设置在容易导入基因突变的富含GC 序列区域。

【方法1】

含-(GA)8-或-(CA)8-重复序列的500 bp DNA片段（在λDNA来源的DNA序列中插入了重复序列）使用各种PCR酶，按照各酶的操作流程进行PCR扩增。将各自PCR扩增产物克隆至载体中，并对每种序列挑取复数的克隆进行测序确认碱基序列。以在重复序列中产生的碱基缺失及插入计算错配率。

【方法2】

含-T26-重复序列的500 bp DNA片段（人基因组来源的DNA序列在质粒中克隆后的DNA片段）使用各种PCR酶进行PCR扩增、克隆、对复数的克隆测序后计数T碱基数。

【结果】

重复序列的复制错误是因为PCR酶对模板的识别能力下降，校正活性（3' → 5'exonuclease 活性）不能修复。因此即使是具有校正活性的高保真α型DNA polymerase，与不具备校正活性的Taq DNA polymerase相比，其复制重复序列的保真性不一定更好。
从本次实验结果可以看出，添加独自研发的延伸因子的大幅提高了酶合成能力（processivity）的PrimeSTAR^® Max 和PrimeSTAR^® GXL，在扩增重复序列时具有优良的保真性（表1、图2）。

表1. 各种PCR酶对重复序列［-(GA)8-、-(CA)8-的保真性

-(GA)8-

	全部克隆数	重复序列的碱基缺失和插入			突变克隆数	突变克隆数的比例
	全部克隆数	（GA）2组缺失	（GA）1组缺失	（GA）1组插入	突变克隆数	突变克隆数的比例
Taq	261	3	21	2	26	10.00%
PrimeSTAR^® HS	250	5	25	2	32	12.80%
PrimeSTAR^® Max	201	0	5	0	5	2.49%
PrimeSTAR^® GXL	167	0	4	0	4	2.40%
A公司α型酶1	131	2	15	1	18	13.74%
A公司α型酶2	172	2	15	9	26	15.12%

-(CA)8-

	全部克隆数	重复序列的碱基缺失和插入			突变克隆数	突变克隆数的比例
	全部克隆数	（GA）2组缺失	（GA）1组缺失	（GA）1组插入	突变克隆数	突变克隆数的比例
Taq	269	0	12	2	14	5.20%
PrimeSTAR^® HS	253	1	8	3	12	4.47%
PrimeSTAR^® Max	212	0	3	1	4	1.89%
PrimeSTAR^® GXL	167	0	3	0	3	1.80%
A公司α型酶1	131	0	8	1	9	6.87%
A公司α型酶2	179	1	7	10	18	10.06%

图2. 各种PCR酶对重复序列[-T26-]保真性