TaKaRa LA Taq

LA PCR时模板DNA的制备方法及使用量
 
    超过10 kb以上的LA PCR扩增反应,不适合使用采取简单方法(例如:只进行细胞热处理或蛋白酶处理)提取的DNA作为模板。建议使用经过充分纯化的完整DNA(没有Nick等)作为模板。
 
    以下为提取Human Genomic DNA和大肠杆菌Genomic DNA时的一般操作方法:
Human Genomic DNA纯化法
    以HL60培养细胞(1.5×109 Cells)为例。
    1、将培养的HL60细胞(1.5×109 Cells)收集后,用0.7%的NaCl溶液清洗两次。
    2、用15 ml的10 mM Tris-HCl(pH8.3)将细胞重悬。
    3、在细胞重悬液中加入150 μl的Proteinase K(10 mg/ml)和150 μl的SDS(10%)进行裂解。60℃温育1小时后,再在37℃温育16小时。
    4、将15 ml的0.1 M Tris-HCl(pH8.0)饱和的苯酚加入上述溶液中,轻轻上下颠倒混合15分钟。
    5、9,000 rpm(约6,000×g)离心10分钟。
    6、将水相(上层)移至另一新的离心管中。再加入15 ml的0.1 M TE buffer(pH8.0)饱和的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),轻轻上下颠
       倒混合15分钟。
    7、室温下9,000 rpm(约6,000×g)离心10分钟。
    8、将水相(上层)移至另一新的离心管中。再加入15 ml的氯仿/异戊醇(24:1),轻轻上下颠倒混合15分钟。
    9、室温下9,000 rpm(约6,000×g)离心10分钟。
   10、将水相(上层)移至另一新的离心管中。加入1.5 ml的3 M醋酸钠(pH5.2)和30 ml的99.5%乙醇,轻轻上下颠倒混合。
   11、用细玻璃棒将DNA缠于玻璃棒上取出。
   12、用80%乙醇冲洗缠有DNA的玻璃棒,干燥处理。
   13、用10 ml的TE Buffer溶解DNA(将缠有DNA的玻璃棒放入TE Buffer中,4℃放置一夜)。然后加入100 μl的RNase A(10 mg/ml),
       37℃温育1小时。
   14、加入10 ml的0.1 M Tris-HCl(pH8.0)饱和的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),轻轻上下颠倒混合5分钟。
   15、9,000 rpm(约6,000×g)离心10分钟。
   16、将水相(上层)转移至另一新的离心管中。再加入10 ml的氯仿/异戊醇(24:1)。轻轻上下颠倒混合5分钟。
   17、9,000 rpm(约6,000×g)离心10分钟。
   18、将水相(上层)移至另一新的离心管中。加入1 ml的3 M醋酸钠(pH5.2)和20 ml的乙醇,轻轻上下颠倒混合15分钟。
   19、用细玻璃棒将DNA缠于玻璃棒上取出。
   20、用80%乙醇冲洗缠有DNA的玻璃棒,干燥处理。
   21、用2 ml的TE Buffer溶解DNA(将缠有DNA的玻璃棒放入TE Buffer中,4℃放置一夜),然后调整DNA终浓度为0.5 mg/ml。
 
大肠杆菌Genomic DNA纯化法
    1、将200 ml L-Broth过夜培养(使用2 L烧瓶)的大肠杆菌2瓶离心收集菌体。用40 ml的Buffer(50 mM EDTA,50 mM Tris-HCl,
       pH8.0)重悬。
    2、-80℃冷冻处理30分钟。
    3、将4 ml的0.25 M Tris-HCl(pH8.0)溶解的溶菌酶(10 mg/ml)加入到冷冻后的菌液中,室温下融化并均匀混合,融化后的菌体于冰中放
       置45分钟。
    4、加入8 ml的STEP(0.5% SDS,50 mM Tris-HCl pH8.0,0.4 M EDTA,1 mg/ml Proteinase K)50℃温育1小时。
    5、加入45 ml的TE Buffer(10 mM Tris-HCl pH8.3,1 mM EDTA)。然后再加入96 ml的0.1 M Tris-HCl(pH8.0)饱和的苯酚/氯仿/异
       戊醇(25:24:1),上下颠倒轻轻混合5分钟。
    6、5,000 rpm(约4,000×g)离心15分钟。
    7、将水相(上层)移至另一新的离心管中。再加入96 ml的氯仿/异戊醇(24:1),轻轻上下颠倒混合5分钟。
    8、5,000 rpm(约4,000×g)离心15分钟。
    9、将水相(上层)移至另一新的离心管中。加入9 ml的3 M醋酸钠(pH5.2)和225 ml的乙醇,轻轻上下颠倒混合。
   10、用细玻璃棒将DNA缠于玻璃棒上取出。
   11、用80%乙醇冲洗缠有DNA的玻璃棒,干燥处理。
   12、用20 ml的TE Buffer溶解DNA(将缠有DNA的玻璃棒放入TE Buffer中,4℃放置一夜)。然后加入200 μl的RNase A(10 mg/ml),
       37℃保温30分钟。
   13、加入20 ml的0.1 M Tris-HCl(pH8.0)饱和的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),轻轻上下颠倒混合5分钟。
   14、10,000 rpm(约7,500×g)离心15分钟。
   15、将水相(上层)转移至另一新的离心管中,再加入20 ml的氯仿/异戊醇(24:1)。轻轻上下颠倒混合5分钟。
   16、10,000 rpm(约7,500×g)离心10分钟。
   17、将水相(上层)移至另一新的离心管中,加入2 ml的3 M醋酸钠(pH5.2)和50 ml的乙醇,轻轻上下颠倒混合。
   18、用细玻璃棒将DNA缠于玻璃棒上取出。
   19、用80%乙醇冲洗缠有DNA的玻璃棒,干燥处理。
   20、用20 ml的TE Buffer溶解DNA(将缠有DNA的玻璃棒放入TE Buffer中,4℃放置一夜),然后调整DNA终浓度为0.1 mg/ml。
 
■ 模板DNA的推荐使用量如下:
Human genome DNA: 0.1 μg~1 μg/50 μl PCR
E. coli Genome DNA: 10 ng~100 ng/50 μl PCR
λ DNA: 0.5 ng~2.5 ng/50 μl PCR