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PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase

高速PCR操作流程

1. PCR反应液的配制。

试剂	使用量	终浓度
5× PrimeSTAR GXL Buffer	10 μl	1×
dNTP Mixture（2.5 mM each）	4 μl	200 μM each
Primer 1	10-15 pmol	0.2-0.3 μM^*
Primer 2	10-15 pmol	0.2-0.3 μM^*
Template	参考最适参数的设定(3)
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase	2 μl	2.5 U/50 μl
灭菌蒸馏水	up to 50 μl

* 扩增10 kb以上的大片段DNA时，引物的终浓度为0.2 μM。

2. PCR反应条件。

【扩增DNA片段≦10 kb时】

   *1 Tm值（按照下面的公式计算）为55℃以上时→退火温度设定为60℃。
       Tm值为55℃以下时→退火温度设定为55℃。
       ※ Tm值（℃）＝[ (nA＋nT) × 2 ]＋[ (nC＋nG) × 4 ]－5
       n表示引物中碱基个数

*2 进行3 step PCR反应时，也将Extension温度设定为68℃。

【扩增DNA片段为10 kb-20 kb时】

98℃	10 sec.		30 cycles [2-step PCR]
68℃	20 sec./kb

3. PCR反应条件的选择。

① 扩增10 kb以下DNA片段时，请使用3 step PCR，不建议使用2 step PCR。

② 扩增10 kb以上DNA片段时，要想缩短反应时间，请使用3 step PCR；要想获得高特异性扩增，建议使用2 step PCR。

③ 对于GC rich模板，建议使用标准操作流程。

④ 无扩增产物或出现Smear、非特异性扩增产物时，请参照Troubleshooting进行调整。