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PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase

高速PCR操作流程
 
1. PCR反应液的配制。
试剂 使用量 终浓度
 5× PrimeSTAR GXL Buffer 10 μl   1×  
 dNTP Mixture(2.5 mM each) 4 μl   200 μM each  
 Primer 1 10-15 pmol   0.2-0.3 μM*  
 Primer 2 10-15 pmol   0.2-0.3 μM*  
 Template 参考最适参数的设定(3)    
 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 2 μl   2.5 U/50 μl  
 灭菌蒸馏水 up to 50 μl    
   * 扩增10 kb以上的大片段DNA时,引物的终浓度为0.2 μM。
 
2. PCR反应条件。
   【扩增DNA片段≦10 kb时】
            98℃         10 sec. 30 Cycles [3-step PCR]
            55℃ or 60℃*1         15 sec.
            68℃*2         10 sec./kb
   *1 Tm值(按照下面的公式计算)为55℃以上时→退火温度设定为60℃。
       Tm值为55℃以下时→退火温度设定为55℃。
       ※ Tm值(℃)=[ (nA+nT) × 2 ]+[ (nC+nG) × 4 ]-5
       n表示引物中碱基个数
   *2 进行3 step PCR反应时,也将Extension温度设定为68℃。
   【扩增DNA片段为10 kb-20 kb时】
              98℃         10 sec. 30 cycles [2-step PCR]
              68℃         20 sec./kb
               or
              98℃         10 sec. 30 Cycles [3-step PCR]
              60℃         15 sec.
              68℃         10 sec./kb
 
3. PCR反应条件的选择。
   ① 扩增10 kb以下DNA片段时,请使用3 step PCR,不建议使用2 step PCR。
   ② 扩增10 kb以上DNA片段时,要想缩短反应时间,请使用3 step PCR;要想获得高特异性扩增,建议使用2 step PCR。
   ③ 对于GC rich模板,建议使用标准操作流程。
   ④ 无扩增产物或出现Smear、非特异性扩增产物时,请参照Troubleshooting进行调整。