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PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase

标准PCR操作流程

不仅介绍了延伸时间为1 min/kb的标准PCR反应操作流程，还介绍了DNA聚合酶的使用量为2倍、延伸时间为10 sec./kb的高速PCR反应的操作流程。
PCR反应液的配制可在室温下进行，但DNA聚合酶等各种试剂在配制前请于冰上放置。

1. PCR反应液的配制。

试剂	使用量	终浓度
5× PrimeSTAR GXL Buffer	10 μl	1×
dNTP Mixture（2.5 mM each）	4 μl	200 μM each
Primer 1	10-15 pmol	0.2-0.3 μM^*
Primer 2	10-15 pmol	0.2-0.3 μM^*
Template	参考最适参数的设定(3)
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase	1 μl	1.25 U/50 μl
灭菌蒸馏水	up to 50 μl

* 扩增10 kb以上的大片段DNA时，引物的终浓度为0.2 μM。

2. PCR反应条件。

【扩增DNA片段≦10 kb时】

98℃	10 sec.		30 Cycles [2-step PCR]
68℃	1 min./kb

   *1 Tm值（按照下面的公式计算）为55℃以上时→退火温度设定为60℃。
       Tm值为55℃以下时→退火温度设定为55℃。
       ※ Tm值（℃）＝[ (nA＋nT) × 2 ]＋[ (nC＋nG) × 4 ]－5
       n表示引物中碱基个数

*2 进行2 step PCR和3 step PCR反应时，均可以将Extension温度设定为68℃。

【扩增DNA片段为10 kb-30 kb时】

98℃	10 sec.		30 Cycles
68℃	10 min

【扩增DNA片段为≧30 kb时】

98℃	10 sec.		30 Cycles
68℃	15 min

3. PCR反应条件的选择。

① 扩增10 kb以下DNA片段时，请先尝试3 step PCR。

② 对GC rich模板或扩增10 kb以上DNA片段时，推荐使用2 step PCR。

③ 无扩增产物或出现Smear、非特异性扩增产物时，请参考Troubleshooting进行调整。