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RNAiso Plus

鸡软骨及骨组织中的RNA提取

[使用试剂]

RNAiso Plus（Code No. 9108）

High-Salt Solution for Precipitation (Plant)（Code No. 9193）

[检测样品]

鸡软骨组织 200 mg

鸡骨组织 200 mg

[方法]

1. RNA提取

	·	将200mg鸡软骨组织和骨组织移至乳钵中，边加液氮边研磨至粉末。
	·	液氮挥发后，加入4ml RNAiso Plus，再次进行匀浆后按照RNAiso Plus的操作流程进行了RNA提取。但是在异丙醇沉淀时，加入0.25倍RNAiso Plus体积量的High-Salt Solution for Precipitation (Plant)混合，再加入0.25倍RNAiso Plus体积量的异丙醇，混合后再按照RNAiso Plus的操作流程回收了total RNA。最后溶解于30 μl RNase-free water。
	·	与没有添加High-Salt Solution for Precipitation (Plant)的相同检测样品按照RNAiso Plus的操作流程回收的total RNA进行了比较。

2. RT-PCR

使用1提取的RNA对β-actin进行了RT-PCR。使用扩增mRNA来源和基因组DNA来源DNA时扩增片段大小不同的引物，对混入的基因组DNA进行了确认。

[结果]

1. 提取RNA的电泳结果

＜软骨组织＞

Lane：	提取方法
1、2：	RNAiso Plus
3、4：	RNAiso Plus＋High-Salt Solution for Precipitation (Plant)

＜骨组织＞

Lane：	提取方法
1、2：	RNAiso Plus
3、4：	RNAiso Plus＋High-Salt Solution for Precipitation (Plant)

Total RNA 5 μl Apply

1% Agarose

M： DL2,000 DNA Marker

2. 提取RNA的收量和纯度

＜软骨组织＞

＜骨组织＞

*1 RNA量：利用A260计算出的值

*2 仅使用RNAiso Plus提取的检测样品中因含有大量的多糖等杂质，认为A260的测定值没有反映出准确的RNA量。

3. 提取的RNA进行了RT-PCR反应

RNA Sample：	各500 ng
RT Primer：	Oligo dT Primer
反转录酶：	Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)（Code No. 2641）
PCR酶：	TaKaRa LA Taq（Code No.RR002A）
反转录反应：	10 μl
PCR反应体系：	50 μl（使用2 μl反转录反应液）
Target：	β-actin
mRNA来源的扩增片段大小：	561bp
genome DNA来源的扩增片段大小：	561bp
PCR 条件：	98℃ 30 sec.	30 cycles
	55℃ 10 sec.
	72℃ 1 min.

＜骨组织＞

PCR反应液 10μl上样

3% Agarose

M：100 bp DNA Ladder

［总结］

	·	使用RNAiso Plus从骨和软骨中提取RNA过程中，在异丙醇沉淀沈时加入High-Salt Solution for Precipitation (Plant)后回收RNA、可制备A260/A280比值高于1.8的高纯度total RNA。软骨来源RNA进行凝胶电泳时还可确认到核糖体RNA片段。
	·	从RT-PCR的结果可以看出，从软骨中提取RNA时，仅使用RNAiso Plus 提取的RNA有微弱的扩增产物，而使用High-Salt Solution for Precipitation (Plant)提取的RNA，软骨来源和骨来源均可获得清晰的扩增产物。此外，二者在RTase（－）的扩增结果中没有确认到基因组来源的扩增产物。
	·	一般从骨和软骨组织中很难提取RNA，但使用RNAiso Plus提取RNA时与High-Salt Solution for Precipitation (Plant)并用可获得如本实验所示的高纯度RNA。