Takara

TB Green^® Premix Ex Taq^™ II (Tli RNaseH Plus)

应用LightCycler/LightCycler 480 System Real Time PCR扩增仪的操作方法

1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。考虑到吸取误差，配置的预混液体积要至少多于所有反应用总体积的10%。

试剂	使用量	终浓度
TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2X）	10 μl	1X
PCR Forward Primer（10 μM）	0.8 μl	0.4 μM^*1
PCR Reverse Primer（10 μM）	0.8 μl	0.4 μM^*1
DNA模板（<100 ng）^*2	2.0 μl
灭菌水	6.4 μl
Total	20.0 μl

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1-.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 在20 μl的反应体系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定合适的DNA模板添加量。另外，2 Step RT-PCR反应的cDNA（RT反应液）作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

2. 进行Real Time PCR反应。

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。

两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1：预变性
	95℃ 30秒 20℃/秒
	1 Cycle
Stage 2：PCR反应
	95℃ 5秒 20℃/秒
	60℃ 20秒 20℃/秒
	40 Cycles
Stage 3：融解曲线分析
	95℃ 0秒 20℃/秒
	65℃ 15秒 20℃/秒
	95℃ 0秒 0.1℃/秒

< LightCycler 480 System>

预变性

95℃ 30秒钟（Ramp Rate4.4℃/秒）

1 cycle

PCR

分析模式：定量分析

95℃ 5 秒钟 (Ramp Rate 4.4℃/秒)

60℃ 30 秒钟. (Ramp Rate 2.2℃/秒，Acquisition Mode : Single)

40 cycles

融解

分析模式：融解曲线

95℃ 5 秒钟 (Ramp Rate 4.4℃/秒)

60℃ 1 分钟 (Ramp Rate 2.2℃/秒)

95℃ (Ramp Rate 0.11℃/秒, Acquisition Mode : Continuous, Acquisitions : 5 per℃)

1 cycle

降温

50℃ 30 秒钟 (Ramp Rate 2.2℃/秒)

1 cycle

◆特别提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5-15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。

3. 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器操作手册。