TB Green® Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)

 
应用LightCycler/LightCycler 480 System Real Time PCR扩增仪的操作方法
 
1. 按下列组份配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)。考虑到吸取误差,配置的预混液体积要至少多于所有反应用总体积的10%。
试剂 使用量 终浓度
 TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2X) 10 μl   1X  
 PCR Forward Primer(10 μM) 0.8 μl   0.4 μM*1  
 PCR Reverse Primer(10 μM) 0.8 μl   0.4 μM*1  
 DNA模板(<100 ng)*2 2.0 μl    
 灭菌水 6.4 μl    
 Total 20.0 μl    
*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时,可以在0.1-.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 在20 μl的反应体系中,DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时可进行梯度稀释,确定合适的DNA模板添加量。另外,2 Step RT-PCR反应的cDNA(RT反应液)作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
 
2. 进行Real Time PCR反应。
建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序,如果该程序得不到良好的实验结果时,再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因,两步法PCR反应扩增性能较差时,可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。
 
两步法PCR扩增标准程序:
Stage 1:预变性
  95℃ 30秒 20℃/秒
  1 Cycle
Stage 2:PCR反应
  95℃ 5秒 20℃/秒
  60℃ 20秒 20℃/秒
  40 Cycles
Stage 3:融解曲线分析
  95℃ 0秒 20℃/秒
  65℃ 15秒 20℃/秒
  95℃ 0秒 0.1℃/秒
 
< LightCycler 480 System>
 
预变性
      95℃ 30秒钟(Ramp Rate4.4℃/秒)
      1 cycle
PCR
      分析模式:定量分析
      95℃ 5 秒钟 (Ramp Rate 4.4℃/秒)
      60℃ 30 秒钟. (Ramp Rate 2.2℃/秒,Acquisition Mode : Single)
      40 cycles
融解
      分析模式:融解曲线
      95℃ 5 秒钟 (Ramp Rate 4.4℃/秒)
      60℃ 1 分钟 (Ramp Rate 2.2℃/秒)
      95℃ (Ramp Rate 0.11℃/秒, Acquisition Mode : Continuous, Acquisitions : 5 per℃)
      1 cycle
降温
      50℃ 30 秒钟 (Ramp Rate 2.2℃/秒)
      1 cycle
 
◆特别提示:
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶,与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比,不需要PCR反应前的95℃、5-15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长,会使酶的活性下降,其PCR的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性,通常设定为95℃、30秒。
 
3. 实验结果分析。
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线,进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器操作手册。