TB Green® Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)

 
应用Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System和StepOnePlus Real-Time PCR System的操作方法
 
1. 按下列组份配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)。考虑到吸取误差,配置的预混液体积要至少多于所有反应用总体积的10%。
试剂 使用量 使用量 终浓度
 TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2X) 10 μl   25 μl   1X  
 PCR Forward Primer(10 μM) 0.8 μl   2 μl   0.4 μM*1  
 PCR Reverse Primer(10 μM) 0.8 μl   2 μl   0.4 μM*1  
 ROX Reference Dye(50X)or
 ROX Reference Dye II(50X) *2
0.4 μl   1 μl   1X  
 DNA模板 *3 2 μl   4 μl    
 灭菌水 6 μl   16 μl    
 Total 20 μl*4   50 μl*4    
*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时,可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 ROX Reference Dye II(50X)比ROX Reference Dye(50X)浓度低,使用ABI 7500 /7500 Fast Real-Time PCR System时,请使用ROX Reference Dye II(50X)。使用ABI 7300和StepOnePlus Real-Time PCR System时,请使用ROX Reference Dye(50X)。
*3 在20 μl反应体系中,DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时可进行梯度稀释,确定合适的DNA模板添加量。另外,2 Step RT-PCR反应的cDNA(RT反应液)作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
*4 按照各仪器推荐体系进行反应液配制。
 
2. 进行Real Time PCR反应。
建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序,如果该程序得不到良好的实验结果时,再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因,两步法PCR反应扩增性能较差时,可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。
< Applied Biosystems 7300/7500和StepOnePlus Real-Time PCR System >
两步法PCR扩增标准程序:
Stage 1:预变性
  Reps:1
  95℃  30秒
Stage 2:PCR反应
  Reps:40
  95℃  5秒
  60℃  30~34秒*
  Dissociation stage
* 使用StepOnePlus 时请设定在30秒。
使用7300时请设定在31秒。
使用7500时请设定在34秒。
 
< Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System >
两步法PCR扩增标准程序:
Stage 1: 预变性
  Number of Cycles:1
  95℃ 30秒
Stage 2: PCR反应
  Number of Cycles:40
  95℃ 3秒
  60℃ 30秒
Melt Curve Stage
 
◆特别提示:
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶,与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比,不需要PCR反应前的95℃、5-15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长,会使酶的活性下降,其PCR的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性,通常设定为95℃、30秒。
 
3. 实验结果分析。
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线,进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法请参考仪器的操作手册。