Takara

TB Green^® Premix Ex Taq^™ II (Tli RNaseH Plus)

应用Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System和StepOnePlus Real-Time PCR System的操作方法

1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。考虑到吸取误差，配置的预混液体积要至少多于所有反应用总体积的10%。

试剂	使用量	使用量	终浓度
TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2X）	10 μl	25 μl	1X
PCR Forward Primer（10 μM）	0.8 μl	2 μl	0.4 μM^*1
PCR Reverse Primer（10 μM）	0.8 μl	2 μl	0.4 μM^*1
ROX Reference Dye（50X）or ROX Reference Dye II（50X） ^*2	0.4 μl	1 μl	1X
DNA模板 ^*3	2 μl	4 μl
灭菌水	6 μl	16 μl
Total	20 μl^*4	50 μl^*4

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 ROX Reference Dye II（50X）比ROX Reference Dye（50X）浓度低，使用ABI 7500 /7500 Fast Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye II（50X）。使用ABI 7300和StepOnePlus Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye（50X）。
*3 在20 μl反应体系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定合适的DNA模板添加量。另外，2 Step RT-PCR反应的cDNA（RT反应液）作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
*4 按照各仪器推荐体系进行反应液配制。

2. 进行Real Time PCR反应。

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。

< Applied Biosystems 7300/7500和StepOnePlus Real-Time PCR System >

两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1：预变性
	Reps：1
	95℃ 30秒
Stage 2：PCR反应
	Reps：40
	95℃ 5秒
	60℃ 30～34秒^*
	Dissociation stage
* 使用StepOnePlus 时请设定在30秒。使用7300时请设定在31秒。使用7500时请设定在34秒。

< Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System >

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性
	Number of Cycles：1
	95℃ 30秒
Stage 2： PCR反应
	Number of Cycles：40
	95℃ 3秒
	60℃ 30秒
Melt Curve Stage

◆特别提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5-15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。

3. 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法请参考仪器的操作手册。