Takara

PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)

反转录反应：TB Green qPCR分析法

1. 去除基因组DNA反应

按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。

试剂	使用量
5×gDNA Eraser Buffer	2.0 μl
gDNA Eraser	1.0 μl
Total RNA	^*1
RNase Free dH2O	up to 10 μl

↓

42℃ 2 min（或者室温5 min^*2）

4℃

2. 反转录反应

反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装10 μl到每个反应管中^*3。轻柔混匀后立即进行反转录反应。

试剂	使用量
步骤1的反应液	10.0 μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I	1.0 μl
RT Primer Mix ^*4	1.0 μl
5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）	4.0 μl
RNase Free dH2O	4.0 μl
Total	20 μl ^*5




	Master Mix
	10 μl

↓

37℃ 15 min^*6

85℃ 5 sec

4℃^*7

*1: 20 μl反转录反应体系中，TB Green qPCR法最多可使用1 μg的Total RNA，探针qPCR分析法最多可使用2 μg的Total RNA。
*2: 室温反应时，可以延长至30分钟。
*3: 若不配制Master Mix，向步骤1的反应液中添加试剂时，要先加入RNase Free dd2O和5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time)混合均匀，以使gDNA Eraser的活性充分受到抑制，再添加RT Primer Mix、PrimeScript RT Enzyme Mix I，轻轻混匀进行反转录反应。
*4: 使用RT Primer Mix可以高效合成cDNA。因为实验目的不同，也可以不使用RT Primer Mix，而选择Oligo dT Primer或Gene Specific Primer进行反转录反应，引物使用量如下：
Oligo dT Primer 50 pmol／20 μl反应体系
Gene Specific Primer 5 pmol／20 μl反应体系
*5: 反转录体系可以根据需要相应扩大。
*6: 使用Gene Specific Primer时，建议反转录反应条件设置为42℃ 15 min。PCR反应有非特异性扩增时，将温度升到50℃会有所改善。
*7: 合成的cDNA需要长期保存时，请于-20℃或更低温度保存。

注意:

1) 在反转录反应中，TB Green qPCR法的RT Primer Mix 用量为1 μl，探针qPCR分析法的用量为4 μl。

2) 得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，其加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10（V/V）量。