Takara

Premix Ex Taq^™ (Probe qPCR)

应用Thermal Cycler Dice Real Time System III， II and Lite的操作方法

1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂	使用量	终浓度
Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2X）	12.5 μl	1X
PCR Forward Primer（10 μM）	0.5 μl	0.2 μM^*1
PCR Reverse Primer（10 μM）	0.5 μl	0.2 μM^*1
Probe	1 μl	^*2
模板	2 μl	^*3
dH2O（灭菌水）	8.5 μl
Total	25 μl

*1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1-1.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 使用的探针浓度，与使用的Real Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，试剂使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行。使用Thermal Cycler Dice Real Time System时，通常探针终浓度在0.1-0.5 μM范围内进行调整。
*3 模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷贝数不同而不同，进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-PCR反应的cDNA（RT反应液）为模板时，添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

2. 进行Real Time PCR反应。

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。退火/延伸时间可在20-30秒范围内进行调整，推荐使用30秒的条件。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件概述」。

	两步法PCR扩增标准程序：
	Stage 1：预变性
	Cyclet：1
	95℃ 30秒
	Stage 2：PCR反应
	Cycle：40
	95℃ 5秒
	60℃ 30秒

◆特别提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5-15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。

3. 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器的操作手册。