Takara

Premix Ex Taq^™ (Probe qPCR)

应用Applied Biosystem7500/7500 Fast Real-Time PCR System的操作方法

请按照各种仪器使用说明书要求进行实验操作。

1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂	使用量	使用量	终浓度
Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2X）	10.0 μl	25.0 μl	1X
PCR Forward Primer（10 μM）	0.4 μl	1.0 μl	0.2 μM^*1
PCR Reverse Primer（10 μM）	0.4 μl	1.0 μl	0.2 μM^*1
Probe	0.8 μl	2 μl	^*2
ROX Reference Dye II（50X）^*3	0.2 μl	0.5 μl	0.5X
DNA模板	2.0 μl	4.0 μl	^*4
dH2O（灭菌水）	6.2 μl	16.5 μl
Total	20.0 μl^*5	50.0 μl^*5

*1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 使用的探针浓度，与使用的Real Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行。
*3 ROX Reference Dye II（50X）最终使用浓度是0.5X。
*4 在20 μl反应体系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定理想的DNA模板添加量。如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
*5 根据各仪器推荐反应体系进行调整。

2. 进行Real Time PCR反应。

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件概述」。

< 7500 Real-Time PCR System >

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Number of Cycles：1

95℃ 30秒

Stage 2：PCR反应

Number of Cycles：40

95℃ 5秒

60℃ 34秒^*

< 7500 Fast Real-Time PCR System >

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Number of Cycles：1

95℃ 20秒

Stage 2：PCR反应

Number of Cycles：40

95℃ 3秒

60℃ 30秒

◆特别提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5-15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。

3. 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器的操作手册。