Takara

无标题文档

PrimeScript^™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit

1st-Strand cDNA合成反应

[标准操作流程]

1. 在Microtube中配制下列反应混合液。

试剂	使用量
Oligo dT Primer (50 μM) or Random 6 mers (50 μM)	1 μl 1 μl (0.4～2 μl)^*1
dNTP Mixture (10 mM each)	1 μl
模板RNA	Total RNA：5 μg 以下 Poly(A)^＋ RNA：1 μg 以下
RNase free dH2O	Up to 10 μl

2. 65℃保温5 min后，冰上迅速冷却。(注：上述处理可使模板RNA变性，提高反转录效率。)

3. 在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，总量为20 μl。

试剂	使用量
上述变性后反应液	10 μl
5×PrimeScript II Buffer	4 μl
RNase Inhibitor (40 U/μl)	0.5 μl (20 U)
PrimeScript II RTase (200 U/μl)	1 μl (200 U)
RNase free dH2O	Up to 20 μl

4. 缓慢混匀。

5. 按下列条件进行反转录反应：

(30℃ 10 min) (使用Random 6 mers时)

42℃ (～50℃ )^*2 30～60 min

6. 95℃ 5 min^*3 (酶失活)后，冰上冷却。

*1： 2 kb以下的cDNA合成时，Random 6 mers的使用量为1～2 μl；2 kb以上的cDNA合成时，Random 6 mers的使用量为0.4～1 μl。也可使用Gene Specific Primer，此时，其在反应体系中的终浓度为0.1 μM。
*2： PrimeScript II RTase对具有复杂二级结构的模板同样具有良好的延伸性能，通常可在42℃下进行反应。使用特异性下游引物进行反转录时，有时会因错配而产生非特异性扩增。此时可将反转录温度升到45～50℃，可能会减少非特异性扩增。
*3：进行长片段cDNA扩增时，为了避免1st cDNA链的破损，请进行70℃、15 min的失活反应。