E.coli DH5α Competent Cells

 
质粒载体转化方法
 
1. E.coli DH5α Competent Cells 使用前在冰上融化。
2. 轻微混匀,取100 μl装入14 ml 圆底 tube中(BD Falcon 352059 或352057)。
   注意:不能剧烈振荡混合细胞。
3. 加入DNA样品(建议≤10 ng)。
4. 冰中放置30分钟。
5. 42℃放置45秒。
6. 冰中放置1-2分钟。
7. 添加SOC培养基(预先在37℃保温)至终体积1 ml。
8. 37℃振荡培养1小时(160-225 rpm)。
9. 取适量涂布于选择培养基*
10. 37℃过夜培养。
  *:直径9cm的平板的涂布量不超过100 μl。如有需要,使用步骤7中的培养基进行稀释。
 
注意事项
1. 将感受态细胞从-80℃冷冻取出后请立即置于干冰/乙醇中。使用前保存于干冰/乙醇中。
2. 可使用1.5 ml microcentrifuge tubes代替14 ml 圆底 tubes (BD company Code: 352059 或 352057,等),但效率可能会降低。
3. 当使用100 μl感受态细胞时,加入的高纯度DNA样品不要超过10 ng。否则转化效率会降低。
4. 当改变感受态细胞数量或tube类型时,适当调整反应条件。例如,当使用1.5 ml microcentrifuge tubes时,42℃放置60秒而不是45秒。
5. L-broth 或φ b-broth可替代SOC培养基。此时,转化效率可能会降低。
· L-broth : Ingredient per liter water
  Bacto tryptone 10 g
  Bacto yeast extract 5 g
  NaCl 5 g
   用1 N NaOH调整pH到7.5并高压灭菌。
· φ b-broth: Ingredient per liter water
  Bacto tryptone 20 g
  Bacto yeast extract 5 g
  MgSO4·7H2O 5 g
   用1 N KOH调整pH到7.5并高压灭菌。
6. 当加入X-Gal时,按照以下操作进行:
 ·将 20 mg/ml X-Gal (溶解于二甲基甲酰胺) 按200-300 μl/100 ml的比例加入到 agar培养基中。
7. DH5α可用于M13mp载体的复制。但由于其不携带F因子,因而不能形成菌斑。
8. 不建议将解冻的感受态细胞再次冷冻保存。但是,如果再次冻结不可避免,将细胞置于干冰/乙醇中迅速冷冻,置于-80℃保存。但是,转化效率可能会降低至少一个数量级。