Takara

TB Green^® Premix Ex Taq^™ (Tli RNaseH Plus)

应用Smart Cycler II System扩增仪的操作方法

1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂	使用量	终浓度
TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2X）	12.5 μl	1X
PCR Forward Primer（10 μM）	0.5 μl	0.2 μM^*1
PCR Reverse Primer（10 μM）	0.5 μl	0.2 μM^*1
DNA模板（<100 ng）^*2	2 μl
灭菌水	9.5 μl
Total	25 μl

*1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定合适的DNA模板添加量。如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

2. 进行Real Time PCR反应。

PCR反应管请用Smart Cycler离心机轻轻离心后放入Smart Cycler中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。

两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1：预变性
	Hold
	95℃ 30秒
Stage 2：PCR反应
	Repeat：40
	95℃ 5秒
	60℃ 20秒
Stage 3：Melt Curve

◆特别提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5-15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。

3. 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。
使用Smart Cycler System进行分析时，请参考仪器的操作手册。