ThruPLEX Tag-seq Kit适用于什么类型的样品？

机构用户解决方案

产品选择指南

一般PCR相关制品

PCR Enzyme的选择 PCR原理说明 Takara优选酶多功能酶高保真酶：PrimeSTAR系列基本PCR：Taq系列 Powerful PCR：MightyAmp系列直接电泳的酶制品特殊用途：多重PCR，防污染等高端PCR酶（Clontech） DNA PCR相关制品 RNA PCR相关制品 PCR Subtraction相关制品 PCR仪器
等温扩增相关制品

等温扩增酶
定量PCR相关制品

qPCR学习中心反转录反应（qPCR专用）反转录反应试剂(Clontech) 嵌合荧光法检测(Takara) 嵌合荧光法检测(Clontech) miRNA 嵌合荧光法检测探针检测 Cycleave探针检测 qPCR－仪器 qPCR Primer qPCR－RNA/DNA的制备
cDNA合成 & 克隆

克隆学习中心 DNA Ligation TA克隆和平滑末端克隆 In-Fusion无缝克隆 cDNA合成&文库构建 SMART全长cDNA合成&文库构建 Random Mutagenesis Site-Directed Mutagenesis 基因组DNA序列调取试剂盒 Vector（克隆用）感受态细胞修饰酶/Ligases 修饰酶/磷酸酶、激酶修饰酶/DNA & RNA Polymerase 修饰酶/焦磷酸酶修饰酶/RTase、RNase Inhibitor 修饰酶/核酸酶、拓扑异构酶 Nucleotide Buffer（Powder）etc. Others（基因工程相关制品）
NGS相关制品

NGS 学习中心单细胞 RNA-Seq 单细胞 DNA-Seq RNA-Seq DNA-Seq 生殖健康表观遗传学分析免疫库分析单细胞分选系统 NGS关联制品 PCR酶（NGS用）前代RNA-Seq/DNA-Seq制品
自动化系统

自动化学习中心高通量单细胞分选系统ICELL8 cx 及其应用高通量Real-Time PCR系统自动化NGS文库制备系统高通量单细胞分选系统ICELL8应用
核酸提取、纯化及DNA标记

DNA片段、质粒DNA纯化基因组DNA纯化试剂(柱式法) 基因组DNA纯化试剂(试剂型) RNA提取、纯化试剂(柱式法) RNA提取、纯化试剂(试剂型) RNA保存试剂 Small RNA提取试剂体液样品exosome提取试剂病毒核酸纯化试剂盒酵母核酸纯化试剂盒核酸提取及纯化制品-Others DNA标记标记DNA-蛋白质的回收
限制酶

限制酶基本信息常规限制酶系列产品 QuickCut限制酶 RNA限制酶
电泳相关制品

DNA Markers RNA Markers 蛋白质Markers Agarose Loading Buffer 常用缓冲液方便装电泳相关装置
蛋白质互作研究（酵母杂交系统）

Takara酵母杂交学习中心 Matchmaker^® Gold酵母双杂系统 Matchmaker^® Gold酵母单杂系统互作的确认和评价 Matchmaker相关制品
表达调节及蛋白质性能分析

iDimerize^™蛋白质互作诱导系统 ProteoTuner^™蛋白质调节系统 Tet诱导表达系统
蛋白质表达相关制品

E.coli蛋白质表达 Brevibacillus/Bacillus蛋白质表达哺乳动物细胞蛋白质表达昆虫细胞蛋白质合成(Clontech) 无细胞蛋白质合成系统 Protein Refolding
蛋白质纯化、分析和检测

Capturem新型膜技术应用蛋白质样品制备 His标签融合蛋白质纯化 GST标签融合蛋白质纯化生物素标签融合蛋白质纯化 DYKDDDDK标签融合蛋白质纯化 Myc标签融合蛋白质纯化抗体纯化蛋白质IP&Co-IP 糖/磷酸化蛋白质纯化蛋白质检测蛋白质电泳胶染色蛋白质定量蛋白酶（His标签去除）蛋白酶（氨基酸序列分析）
基因导入（Virus、Vectors）

病毒基因传递系统选择向导重组慢病毒(Lentivirus)制品重组逆转录病毒(Retrovirus)制品重组腺相关病毒(AAV)制品重组腺病毒(Adenovirus)制品哺乳动物细胞用载体酵母、丝状真菌用载体植物用载体
转染试剂

Xfect转染试剂选择向导质粒转染试剂 RNA转染试剂 Protein转染试剂
干细胞研究相关制品

干细胞学习中心干细胞基因操作 (Cell reprogramming) 细胞 (Cell) 细胞培养产品 (Cell culture) 抗体 (Antibodies) 分化试剂盒和多能性监测 (Pluripotency and Differentiation ) 基因编辑（Gene Editing）
表观遗传学相关制品

甲基化DNA富集相关制品 PCR/qPCR相关制品 Control Genome DNA 甲基化DNA相关酶制品亚硫酸氢盐处理相关制品
基因组编辑相关制品

CRISPR/Cas9 Cre重组酶基因敲入用长单链DNA制备
荧光蛋白质 & 报告系统

荧光蛋白质按颜色、名称分类荧光蛋白质按用途分类荧光蛋白质相关制品报告系统
抗体 & ELISA & 细胞信号转导

细胞增殖、细胞毒性测定细胞凋亡（Takara）细胞凋亡（Clontech） EIA试剂盒（Takara）免疫染色关联制品细胞信号转导（Clontech）酶活性测定试剂盒脂肪细胞、骨细胞分化试剂抗体（Takara）
细胞 & 培养相关制品

细胞培养相关制品细胞生物学检测试剂细胞解冻仪器
microRNA & RNAi研究相关制品

RNA合成提取及纯化制品 microRNA定量PCR miRNA表达 Small RNA克隆 shRNA表达检测合成siRNA定量 RNAi相关制品
Library & cDNA & RNA

Human cDNA libraries series Mouse cDNA libraries series Rat cDNA libraries series cDNA、Genome DNA Total RNA & Poly A⁺ RNA
糖工学相关制品

糖工学酶糖工学试剂盒 Glycosphingolipid解析试剂
应用检测（食品-环境-人）

活菌DNA检测相关制品防污染相关制品食物中毒检测（PCR）食物中毒检测 (Real Time PCR) 食物中毒检测 (按Target选择) 肉种鉴定相关制品水质检测人感染症检测菌种鉴定支原体检测
仪器相关制品

PCR仪器支持中心 Q-PCR仪 E-PCR仪电泳仪器产品
Clontech相关组分信息表

Clontech相关组分信息表

技术服务信息

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Q-1：ThruPLEX Tag-seq Kit适用于什么类型的样品？: A-1：
ThruPLEX Tag-seq Kit是用于以cell-free DNA和片段化的双链DNA起始制备Illumina NGS的DNA文库试剂盒。ThruPLEX Tag-seq能够生成高GC覆盖的多种文库，1～50 ng DNA起始可以得到再现性好的测序结果。

Q-2：ThruPLEX Tag-seq Kit与其他的ThruPLEX Kit的主要区别是什么？: A-2：
ThruPLEX Tag-seq Kit包含特别设计的ThruPLEX Stem-Loop 接头，该接头中含有能够识别各起始DNA片段的分子标签UMT。每个试剂盒包含超过1,600万种以上的分子标签，用于在扩增前标记每条DNA片段，可以在文库制备、目标富集和数据分析过程中追踪DNA片段，从而能够高灵敏度且高特异性的检测低频变异。

Q-3：分子标签（UMT）的作用是什么？: A-3：
ThruPLEX Tag-seq文库的制备过程中，为标记识别起始的DNA片段，在连接步骤中加入分子标签（UMT）。具有不同UMT的测序reads代表不同的原始分子，具有相同UMT的测序reads是相同原始分子经PCR扩增的结果。后续进行数据处理时将带有相同UMT的测序reads分为一组，每一组称为一个扩增家族，比较各扩增家族内部的reads能够去除扩增错误和测序错误，得到共有序列后能够进一步提高变异检出的准确度。

Q-4：ThruPLEX Tag-seq识别用分子标签（UMT）有多少个？: A-4：
通过ThruPLEX Stem-Loop adaptor的连接，在每个ThruPLEX Tag-seq文库DNA片段的两端添加6碱基的随机序列。每个6碱基的随机序列有4⁶（4,096）个组合。DNA片段两端的6碱基序列组合后，能够得到1,600万（4,096 × 4,096）个分子标签，通过这些分子标签能够识别Input DNA分子。

Q-5：检测1％频率的等位基因变异需要的DNA起始量？

A-5：

为实现所需的检测灵敏度，需要制备含有足够变异体拷贝数的文库，此时适当的DNA起始量非常重要。通常情况下等位基因存在的频率越低，所需的起始DNA量就越多。例如，假设10 ng的DNA样品，含有足够检出1％等位基因所需的拷贝数。详细请见ThruPLEX Tag-seq Kit操作说明书的C.III部分及下述表格。由于在文库制备及靶标富集时DNA有损失，因此能够检出的拷贝数低于下表所列的数值。

Estimated Genome Copies Available for Library Preparation
CInput mount	Total Haploid Genome Copies^*	Total Variant Copies at Indicated Allele Frequency
CInput mount	Total Haploid Genome Copies^*	5％	1％	0.5％
50 ng	16,666	833	16,666	83
30 ng	10,000	500	100	50
10 ng	3,333	166	33	16
5 ng	1,666	83	16	8
1 ng	333	16	3	1

* Calculated using 3 pg as the mass of a haploid genome. The genomic complexity of plasma samples is highly variable. All numbers rounded down to nearest whole number.

Q-6：ThruPLEX Tag-seq文库测序需要多大的深度（depth）？

A-6：

利用ThruPLEX Tag-seq文库的分子标签构建共有序列，需要足够的覆盖度。通常情况下等位基因存在的频率越低，检出所需的测序深度越高。例如，目的峰扩增家族大小为每1分子10个reads，为确定变异最少需要3个分子的情况下，读取等位基因频率为5%的变异体至少需要600x的测序深度。同样，等位基因变异频率为1%突变体的确定至少需要3000x，等位基因变异频率为0.5%则需要6000x的覆盖度。详细内容请参考ThruPLEX Tag-seq Kit操作说明书的C.III部分及下表。
关于所需reads相关的内容请见下述链接
https://www.takarabio.com/learning-centers/next-generation-sequencing/technology-and-application-overviews/sequencing-depth-for-smarter-thruplex-tag-seq

Estimated Mean Raw Sequencing Depth Required^*
Minimum number of Unique Molecules to Make a Variant Call	Allele Frequency
Minimum number of Unique Molecules to Make a Variant Call	5％	1％	0.5％
3	600x	3,000x	6,000x
5	1,000x	5,000x	10,000x
10	2,000x	10,000x	20,000x

* Raw sequencing depth includes all reads prior to removal of duplicates. This is calculated using a target peak amplification family size of 10 reads per unique molecule.
例如：1％ Allele Frequency，每个 unique molecule需要10个reads, 每个variant call需要3个 unique molecules时，（3/0.01）× 10＝3,000×的Coverage Sequencing Depth= (number of unique variants required to make a variant call/allele frequency)*approximate number of reads in each amplification family

Q-7：是否有与ThruPLEX Tag-seq Kit配套使用的靶标富集系统？: A-7：
有，ThruPLEX Tag-seq kit可与Agilent SureSelect、Roche NimbleGen SeqCap EZ、IDT xGen等主要的靶标富集制品搭配使用。靶标富集的protocol请见以下链接内容：
https://www.takarabio.com/learning-centers/next-generation-sequencing/dna-seq-protocols

Q-8：ThruPLEX Tag-seq Kit合成的文库是否可以与其他的Illumina NGS文库在相同的lane中分析？: A-8：
可以，ThruPLEX Tag-seq文库，可在同一个lane中与其他Illumina NGS用文库一起测序。但是，需要在各样品中预先加入不同的index，同时需要注意测序的覆盖度要充足。利用分子标签（UMT），ThruPLEX Tag-seq文库经靶标富集后通常需要使用较高的深度测序。

Q-9：ThruPLEX Tag-seq文库得到的测序数据应该如何处理？: A-9：
通过使用分子标签（UMT）得到的ThruPLEX Tag-seq文库的测序数据，首先要按照每个扩增家族分成组, 然后构建共有序列。针对于ThruPLEX Tag-seq文库的数据处理推荐使用以下2个专用数据分析的平台：
·Curio
Curio是由Curio Genomics提供的基于云计算平台。使用时，可简单的将ThruPLEX Tag-seq文库的测序数据上传、处理及可视化。该平台具有快速、用户友好的界面和高效的alignment viewer。同时该平台还配有模拟变异体检出、分析及可视化过程的模型。详细请见以下链接www.curiogenomics.com

·Connor
在GitHub（https://github.com/umich-brcf-bioinf/Connor）上有Connor版块，是可以处理ThruPLEX Tag-seq文库数据的开放型生物信息分析工具。输入alignment之后的BAM文件，处理UMT信息，之后生成含有共有序列的BAM输出文件。输出的BAM文件可用于如FreeBayes、VarScan2及GATK HaplotypeCaller等的variant caller工具。

Q-10：如果想利用身边现有的生物信息分析Pipeline数据的话，应怎样处理从ThruPLEX Tag-seq文库得到的测序数据？: A-10：
由于每个Pipeline均不相同，因此推荐使用ThruPLEX Tag-seq文库处理用的开放型生物信息分析工具-Connor。如果想改变您现有的Pipeline，下述信息可能会对您有帮助。ThruPLEX Tag-seq文库的两端各带有6碱基的识别用分子标签（UMT）。UMT无论是从Read 1开始还是从Read 2开始读取都是最初的碱基，然后是8～11个碱基的Stem序列，接下来是template DNA序列。文库构造的详细信息请参考ThruPLEX Tag-seq Kit操作说明书。